牛源产酸芽孢杆菌的分离筛选及益生特性研究

王 婷,安明轩,李正浩,胡瑞瑞,王 悦,倪 伟,胡圣伟

(石河子大学生命科学学院,新疆石河子 832000)

自1950年代以来,抗生素已被用于畜牧业中,用于促进生长、治疗和预防疾病。抗生素在制药领域生产高达80%用于食品生产,大多数抗生素被用作饲料添加剂来促进动物的生长[1]。然而,研究表明,滥用抗生素导致威胁动物健康和人类健康的多重耐药病原体的出现,抗生素耐药性的出现,使得耐药菌株在体内大量繁殖,造成动物体内菌群失调问题以及抗生素本身的残留性问题越来越严重,影响正常机体健康[2];因此需要寻找一种可用于临床及生产的抗生素的代替品,近年来,微生物作为饲料添加剂应用于畜牧业也得到了认可,国内外研制也出了多种益生菌活菌制剂[3],益生菌活菌制剂来替代抗生素作为一种新的饲料添加剂必将成为一种新趋势。

益生菌被定义为活的非病原微生物的单一和/或混合培养物,当给予适当数量时,可以为宿主提供益处[4]。动物体内常见的有益的细菌或真菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、丁酸梭菌等。芽孢杆菌是一类在不良环境中能形孢子的革兰氏阳性细菌,具有很强的抵抗力和有较高的稳定性[5];芽孢杆菌为需氧菌[6],为多数厌氧或兼性厌氧菌提供有利的生存环境,间接发挥益生效果;产酸芽孢杆菌[7]有较强的产孢能力,具有产乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的益生特性,能够降低pH抑制有害菌的生长,维持肠道健康;芽孢杆菌在生长繁殖过程中会合成多种维生素、酸性物质和促生长因子等物质,为机体提供营养。研究发现,产酸芽孢杆菌对腹泻、结肠炎、糖尿病等疾病有治疗作用[8]。因此,芽孢杆菌被用作预防或治疗胃肠道疾病的益生菌。本研究旨在从健康牛新鲜粪便样品中分离纯化出产酸芽孢杆菌的细菌,筛选出耐酸、耐胆盐、抗逆性良好,可产生水解酶等特性良好的益生芽孢杆菌菌株,体外抑菌能力和抗生素抗菌性的研究,从而为研制和开发牛源益生菌制剂提供理论依据和优势菌株的选择。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 动物粪便采集于石河子大学动物科技学院动物医院,2020年9月至2020年11月,采集牛新鲜粪便,无菌试管密封包装低温运至实验室。

1.1.2 实验动物 20只雌性C57BL/6小鼠,体重约21 g,购自西安市辉石生物科技有限公司。

1.1.3 主要试剂 溴甲酚绿鉴定培养基,LB(Luria-Bertani)琼脂培养基,MRS肉汤,羧甲基纤维素钠培养基,可溶性淀粉培养基,MH(Mueller-Hinton)琼脂培养基,药敏纸片为杭州微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 生化恒温培养箱(BSP-250),上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品;PCR扩增仪(TC-E-40D),杭州博日科技股份有限公司产品;电泳仪(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司产品;酶标仪(1530),Thermo Fisher Scientific公司(美国)产品;磁力搅拌器(GL-3250A),上海申安医疗科技有限公司产品;立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS),上海申安医疗器械厂产品;超净工作台(SW-CJ-2FD),上海博讯实业有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 牛源产酸菌株的分离与纯化 采集健康牛的新鲜粪便约5 g,置于无菌的50 mL离心管中,20℃保存。对样品进行预处理后,取1 mL稀释液于装有9 mL无菌生理盐水的试管中进行稀释,10-2～10-8各1 mL于溴甲酚绿固体筛选培养基中,进行稀释涂布培养,待凝固后置于37 ℃培养箱恒温培养48～72 h。挑取培养基光滑、边缘完整、较大的菌落,菌落边缘变黄的菌落于液体培养中进行培养。反复进行分离纯化2～3次后,挑取在筛选养基中有生长特征的菌落进行分离纯化,菌种和50%甘油以1∶1混匀后置于-20℃保存或-80℃长期保存用于后续验证试验。

1.2.2 菌种鉴定 以分离纯化后的单菌落为模板, 细菌通用引物(27F 5′-AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3′, 1492R 5′-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3′)进行PCR扩增16S rRNA基因片段。PCR扩增体系:模板0.4 μL,细菌通用引物0.6 μL,高保真Mix 10 μL,用ddH2O补足到20 μL。PCR扩增程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s, 56℃ 30 s,72℃ 1 min 30 s,35个循环,72℃ 3 min,4℃结束反应。并设置阴性对照。增完毕后取2 μL PCR扩增产物与10×Loading buffer混匀,进行琼脂糖凝胶电泳检测(琼脂糖浓度为12 g/L),将凝胶置于成像系统下观察结果。将PCR扩增后产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rRNA基因测序,将测序结果在NCBI中的Blast软件进行GenBank同源性比较。

1.2.3 耐酸耐胆盐试验

(1)耐酸试验 将分离菌株按3%比例接种到pH为1.0、2.0、3.0的5 mL MRS肉汤中37 ℃恒温培养3 h、24 h后。于600 nm处测OD值,读取3个重复读数求平均值后,计算存活率即可代表菌株对酸的耐受性。

(2)耐胆盐试验 将分离菌株按3%比例接种到含0.3%、0.5%的牛胆酸盐的 5 mL MRS肉汤中,37℃静置培养3 h,24 h后,于600 nm处测OD 值,读取3个重复读数求平均值后,计算存活率即可代表菌株对胆盐的耐受性。

1.2.4 耐人工肠胃液菌株的筛选 人工胃液的制备:称取10 g胃蛋白酶中加入1 mol/L稀HCl 16.4 mL,蒸馏水定容至1 000 mL,混匀,pH调至2.0,用0.22 μm的无菌滤头过滤待用,4℃冰箱保存。

人工肠液的制备:取K2HPO45.59 g,KH2PO40.41 g,胰蛋白酶10 g,加水定容至1 000 mL,混匀,pH调至8,用0.22 μm的无菌滤头过滤待用,4℃冰箱保存。

活化后的受试菌株离心(6 000 r/min,5 min)收集菌体,用无菌PBS洗涤2次后调整菌体浓度为1×109CFU/mL。各取1 mL菌悬液加入到9 mL的模拟胃液中,混匀;于37℃培养3 h,分别取样并梯度稀释,采用平板计数法测定活菌总数;3 h后,取1 mL上述培养液入到加9 mL模拟肠液中,37℃培养6 h;分别取样100 μL稀释后的对照组(未进行胃肠液处理)、胃液组、肠液组的菌液涂于LB固体琼脂培养基上,在37℃孵育24 h后进行计数并计算存活率。

1.2.5 细菌自凝聚试验 活化后的菌株进行过夜培养,菌液6 000 r/min离心5 min,用PBS洗涤2次,并调节OD600为0.5±0.02,记录为A0;取4 mL菌悬液于37℃静置放置24 h;取上层液体于600 nm波长处测定吸光度,记录为A24;重复进行3次独立试验。菌株的自聚率(%)表示为:

式中:A0为0 h的吸光度;A24为24 h的吸光度。

1.2.6 产水解酶能力测定

(1)产淀粉酶试验 碘液的配制:称取KI 2 g,用50 mL去离子水溶解,迅速称量I20.5 g并加入KI溶液中,用纯水定容到100 mL,搅拌溶解后保存在棕色瓶中,橡皮塞封口。

挑单个菌落点种于淀粉培养基,每个平板点3个重复,一个用水做对照,37 ℃ 培养24 h,用碘液染5 min,分别测量菌落(H)及透明圈直径(C),计算H/C值,取平均值。

(2)产纤维素酶试验 挑单个菌落点种于羧甲基纤维素钠培养基平板,37 ℃培养24 h,用1 mg/mL刚果红染液染10～15 min,1 mol/L NaCl洗15 min,分别测量菌落(H)及透明圈直径(C),计算H/C值,取平均值。

1.2.7 体外抑菌试验 以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌作为指示菌,用牛津杯法筛选益生菌中对常见致病菌有抑制能力的菌株．配制LB琼脂,待培养基冷却,加入100 μL指示菌,摇匀后倒平板,在牛津杯中加入菌液200 μL,37 ℃培养18～24 h,测量抑菌圈直径,检测待测菌株的抑菌能力。

1.2.8 抗菌药物药敏试验 采用K-B纸片琼脂扩散法,取200 μL潜在益生菌菌液在MH琼脂固体培养基中进行涂布,待平板表面稍干,将抗生素纸片均匀间隔放置于表面上,共9种常见抗生素,氨苄西林10 μg/片,红霉素15 μg/片,四环素30 μg/片,庆大霉素 10 μg/片,万古霉素 30 μg/片,链霉素 10 μg/片,氯霉素30 μg/片,克林霉素2 μg/片,氧氟沙星5 μg/片),置于37 ℃恒温培养24 h后,测量抑菌圈直径。抑菌圈直径的测定如下: 用游标卡尺测量抑菌圈直径的最大值与最小值,以二者的平均值确定抑菌圈直径(单位mm)。

1.2.9 对小鼠体重的影响 选择6～8周龄C57BL/6小鼠(清洁级),体重21 g±0.5 g,雌性,饲养环境为SPF级实验动物房。将20只小鼠随机分成2组,为对照组和试验组,每组10只。每组每只小鼠分别灌服200 μL无菌PBS磷酸缓冲液盐溶液和200 μL 1×109CFU/mL混合菌液,连续灌胃28 d,观察并记录小鼠体重变化、健康状态、有无腹泻等状况。

1.2.10 数据处理 所有样品的测定均设有平行组,数据表示为平均值±标准差(SD),试验数据使用SPSS 25.0统计软件进行分析,利用Origin 2022软件绘图。

2 结果

2.1 菌种分离与鉴定结果

本试验中共分离出21株产酸菌株,在溴甲酚绿筛选培养基中菌落边缘变黄为产酸菌株,蓝色为非产酸菌株;以分离纯化后产酸菌株为模板,扩增的后获得的序列片断大小约为1 500 bp(如图2所示),与目的条带相符。PCR产物送公司测序后,使用NCBI中Blast软件将测序结果与数据库中已知菌株的16S rRNA基因序列进行比较鉴定。测序后分析结果,比较并分析同源性较高的序列,鉴定结果如表1所示, 5株地衣芽孢杆菌,7株解淀粉芽孢杆菌,7株枯草芽孢杆菌,2株贝莱斯芽孢杆菌。

表1 牛源芽孢杆菌分离菌株的鉴定结果Table 1 Identification results of bovine Bacillus isolate strains

M.DNA标准DL 2000;0.阴性对照; 1～21.分离菌株M.DNA Marker DL 2000; 0.Negative control; 1-21.Isolated strains图1 分离菌株16srRNA扩增电泳结果图Fig.1 Results of electrophoresis of isolated strain 16srRNA amplification

2.2 耐酸耐胆盐试验的测定

通过分离纯化得到的21株菌株的耐酸耐胆盐性试验结果如表2和表3 所示。在酸性培养基中,随着培养时间的增加菌株的存活率明显下降,3 h时,所有菌株的存活率在56%以上,24 h时菌株存活率下降,可推断出菌株对pH 2.0以上的酸性环境适应良好。耐胆盐试验中,在含有质量为0.5%的胆盐液体培养基中培养24 h,地衣芽孢杆菌BL2、BL4、BL5,解淀粉芽孢杆菌BA7、BA9、BA11,枯草芽孢杆菌 BS13、BS16、BS20及贝莱斯芽孢杆菌 BV17耐受性较高。在含胆盐浓度为0.3%和0.5%的培养基中培养3 h和24 h菌株存活率良好,随着时间的延长菌株的存活率受到了抑制,但在24 h时,以上菌株均能生长繁殖且存活率为50%以上,说明这些菌株在对0.3%和0.5%胆盐含量都均有一定的胆盐耐受能力。因此选择这些菌株作为后续的研究。

表2 分离芽孢杆菌菌株对不同pH值3 h和24 h的体外存活率Table 2 In vitro survival rates of Bacillus strains isolated for different pH values of 3 h and 24 h

表3 分离芽孢杆菌菌株对不同胆盐浓度3 h和24 h的体外存活率Table 3 In vitro survival rates of Bacillus strains isolated for different bile salt concentrations of 3 h and 24 h

2.3 耐人工肠胃液菌株的筛选

将高胆盐含量耐受能力较好的10株芽孢杆菌在人工肠胃液中培养观察菌株存活情况如表4所示。不同的菌株在胃肠液的刺激下降低程度不一致。由表4可知,10株高耐受性牛源分离株在模拟胃肠道溶液中的存活率差异较大,其中地衣芽孢杆菌BL2,解淀粉芽孢杆菌BA7、BA11和贝莱斯芽孢杆菌BV17的存活率最高,在模拟胃液中耐受3 h存活率依次为75.63%、73.75%、87.75%和73.85%,模拟肠液中耐受6 h后存活率为63.92%、61.23%、73.14%和54.87%。表明这些菌株可以很好的在动物胃肠道存活,足以保证达到足够的数量在宿主肠道发挥潜在作用。相反,BL4、BL5、BA9及BS13、BS16、BS20在胃肠道环境中的存活率相对较低,因此,不宜选作益生菌。

表4 菌株对模拟胃液和肠液的耐受率Table 4 Tolerance rate of bacterial strains to simulated gastric juice and intestinal juice

2.4 细菌自凝集试验

四株菌株静置培养24 h后测得了菌株的自凝聚能力大小。结果显示,地衣芽孢杆菌BL2的自聚集率为71.39%,解淀粉芽孢杆菌BA7和BA11的自聚集率分别为44.69%和57.90%,芽孢杆菌BV17的自聚集率为82.64%,其芽孢杆菌BV17细胞自凝聚能力最强。以上结果说明不同菌株的自聚集力的强弱也不同,其中解淀粉芽孢杆菌BA7自凝聚力低于50%,在肠道内定植不宜定植,故选择其他三株芽孢杆菌作为潜在益生菌进行之后的试验。

2.5 产水解酶能力测定

产水解酶试验结果显示,不同菌株的产酶能力不同,在染色后,菌株所产生的水解圈为淡黄色或透明圈。产酶能力的大小结果显示菌株BL2、BA11、BV17能产生淀粉酶和纤维素酶水解圈,BL2产酶能力较强,其产2种酶的能力为1.67±0.22和2.07±0.18,BA11产淀粉酶和纤维素酶的大小1.42±0.37和1.72±0.21,BV17能产生淀粉酶和纤维素酶的能力为1.36±0.16和1.91±0.07。说明这3株菌芽孢杆菌均有产淀粉酶和纤维素酶的能力。

2.6 体外抑菌试验

由以上3株可产生水解酶的菌株对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及大肠埃希氏菌的体外抑制试验结果由表5显示,BL2只对金黄色葡萄球菌有抑制作用,抑菌环直径为11.50 mm±0.52 mm;BA11和BV17对3种病原菌均有抑制作用。

表5 菌株对常见病原菌的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of strains against common pathogens

2.7 抗菌药物药敏试验

本试验选择了氨苄西林、红霉素、四环素、庆大霉素、万古霉素、链霉素、氯霉素、克林霉素、氧氟沙星等9种常见抗菌药物,抗菌药物敏感试验结果显示(表6),除地衣芽孢杆菌BL2对庆大霉素、红霉素、链霉素表现为中度敏感(I),对氨苄西林、氧氟沙星、氯霉素、链霉素、四环素、万古霉素、克林霉素均表现为敏感(S);BA11和BV17对这9种抗菌药物均表现为敏感(S),不产生耐药性,可认为是安全性菌株。

表6 抗菌药物敏感性试验结果Table 6 Results of antimicrobial susceptibility tests

2.8 复合芽孢杆菌对小鼠试验影响

通过用3种芽孢杆菌BL2、BA11、BV17制成混合菌悬液连续饲喂小鼠28 d,对照组和试验组小鼠均无不良反应,精神正常,无腹泻情况和中毒症状;由28 d小鼠体重变化结果显示,试验组与对照组小鼠体重变化率相比较,试验组小鼠体重增重率在第14天后明显高于实验中小鼠,说明3株混合菌株为安全的,并且具有增加体重的作用。

3 讨论

益生菌是一种通过定殖宿主菌群,改变肠道微生物组成和通过调节宿主肠道黏膜和机体免疫和平衡肠道菌群,从而促进机体的营养吸收,抑制病原菌的繁殖,维持肠道健康对宿主有益的活性微生物[9]。研究表明,益生芽孢杆菌可以提高动物体的免疫状态及影响肠道组织的形态[10]。本研究通过从健康牛新鲜粪便样品中分离纯化出产酸芽孢杆菌的细菌,分离菌株进行耐酸、耐胆盐、人工模拟肠胃液、自聚集性、产生水解酶、体外抑菌和抗生素敏感性测试和小鼠试验。初步研究表明,从健康牛新鲜粪便中分离出3株芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌BL2、解淀粉芽孢杆菌BA11、贝莱斯芽孢杆菌BV1具有良好的耐酸耐胆盐、耐药、促生长的益生菌潜能。

目前,细菌失活在益生菌加工和运输过程中最严重的问题之一[11]。肠道环境复杂大多数益生菌存活困难,胃液的pH和小肠中的胆汁浓度通常在3.0左右和0.1%～0.3%范围内,这表明益生菌需要强酸和高浓度胆盐有一定的耐受性才能在肠胃道中定植和发挥作用[12]。本研究从牛肠道微生物分离得到10株耐酸、耐胆盐菌,在pH为2.0、胆盐浓度为0.5%的条件下能生长繁殖且存活率为50%以上,其中4株菌株在体外模拟胃肠道耐受性试验有较高的存活率,这表明4株菌株都能在胃肠道环境中存活,可以作为潜在益生菌为下阶段试验提供基础研究。

自凝集能力[13]是评价菌种定殖能力的重要指标。益生菌的自凝集能力越强,越容易形成肠道黏膜屏障的形成,有利于菌群在肠道中定植。本研究表明,4株芽孢杆菌的自聚集力强弱不同。其中,芽孢杆菌BV17的自聚集率最高为82.64%,解淀粉芽孢杆菌BA7的自聚集率最低为44.69%,因此在后续的实验中只选择了3株自凝集能力较强的芽孢杆菌。

研究表明,在动物饲料中添加适当比例的微生态制剂,可产生蛋白酶[14]、脂肪酶、纤维素酶[15]和淀粉酶等多种水解酶,具有调整肠道微生态平衡,提高动物生长性能的作用。Zeng Z[16]研究表明,从藏牦牛中分离到的地衣芽孢杆菌可以通过提高消化酶活性和肠绒毛长度来提高小鼠的生长性能;地衣芽孢杆菌处理的小鼠在抗氧化能力和与免疫和炎症相关的细胞因子方面表现出优越的特性。本研究中BL2、BA11、BV17能产生淀粉酶和纤维素酶,BL2产酶能力较强,这3株菌芽孢杆菌均有产淀粉酶和纤维素酶的能力,说明3株菌株可能具有促进消化提高生长性能的功能。

抗生素用作治疗疾病和促进动物生长,细菌耐药性[17]是抗生素的广泛使用和滥用产生的一个主要问题,对全球健康构成威胁。由于多种益生菌特性和抗菌特性,益生菌被认为是抗生素的安全替代品。李琼燕[18]研究发现,从蜂蜜中初筛出3株耐高温的疑似芽孢杆菌,并复筛出1株耐酸耐胆盐的菌株BSH,饲喂BSH后给线虫感染肠炎沙门氏菌LT2,发现BSH对秀丽隐杆线虫感染S.LT2具有保护作用。我们在体外抑菌试验中发现,BL2只对金黄色葡萄球菌有抑制作用,抑菌环直径11.50 mm±0.52 mm;BA11和BV17对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及大肠埃希氏菌均有抑制作用。本研究表明,3株菌株对9种抗生素出现敏感性未产生耐药性,可认为是安全菌株不会损害宿主健康。

在小鼠试验中,3株菌株混合灌喂28 d,小鼠未出现不良反应,精神正常,无腹泻情况和中毒症状,而且与对照组相比较,灌喂小鼠体重有所增加,说明3株菌株为安全且具有增重作用的益生菌。在之后的研究中,可以通过动物试验测定混合菌灌喂后对动物体内微生物菌群的影响,提高生长性能作用,为进一步制备牛源益生菌或动物微生态制剂的开发研制提供参考菌株和理论基础。