生物胺降解菌Staphylococcus xylosus JCM 2418 的特性研究及应用

张杨，李歆宇，马新秀，毕景然，张公亮，侯红漫

（大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034）

发酵是最古老的食品保存方法之一，在世界范围内都有较广泛的应用，也是一种生产具有独特感官特征食品的加工方法。发酵食品因其独特的风味和丰富的营养而受到广大消费者的青睐，是人们饮食的重要组成部分[1-2]。微生物在发酵食品感官品质形成中起到重要的作用，能够将糖、肽和脂质转化为有机酸、醇类物质、挥发性和芳香化合物、多糖和其他影响发酵食品质量特性、安全性和保质期的代谢物[3]。

生物胺是一类具有生物活性、含氨基的低分子量有机化合物的总称[4]，存在于多种食品尤其是发酵食品（如奶酪、葡萄酒、啤酒、米酒、发酵香肠、调味品）、水产品及肉类产品等[5]。适量摄入生物胺能促进生长、增强代谢活力、增强免疫力和清除自由基等，但是过量摄入生物胺则会引起头疼、腹部痉挛、呕吐等不良生理反应[6]。生物胺含量过高是发酵食品生产过程中常见的问题，目前，利用具有降解生物胺能力的菌株来减少食品中生物胺的积累是较有优势和应用前景的方法。

从发酵制品中获得的微生物作为发酵剂应用在发酵食品中，不仅可以提高产品安全性，同时能有效缩短发酵周期，提升产品品质，有利于产品的标准化、工业化生产[7]。目前，微生物发酵剂在水产类和肉制品类发酵制品中应用较多。Liao 等[8]将植物乳杆菌和木糖葡萄球菌作为发酵剂接种到传统发酵鱼中，并对生物胺含量进行了监测，发现混合发酵剂对生物胺有降解的作用，尤其是对酪胺；杨洋等[9]以发酵乳杆菌作为带鱼加工下脚料的功能发酵剂用于鱼露生产，发现该菌株可以使鱼露生物胺含量降低，并改善鱼露风味；Hu等[10]将戊糖片球菌、弯曲乳杆菌和木糖葡萄球菌接种到哈尔滨香肠中，考察其对哈尔滨干发酵香肠品质和风味的影响，发现香肠的硬度和弹性得到提高，产生了更高比例的挥发性化合物。

木糖葡萄球菌是《可用于食品的菌种名单》[11]中的菌种，但本研究中的Staphylococcus xylosus JCM 2418是从鱼露中筛选得到的，鉴于此，对Staphylococcus xylosus JCM 2418 的安全性及发酵性能进行评价，并利用高效液相色谱和电子鼻分析该菌株单菌接种在不同发酵食品中对生物胺以及挥发性风味物质的影响，以期为发酵产品提供优良的发酵菌剂提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Staphylococcus xylosus JCM 2418、蜡样芽胞杆菌：大连工业大学食品学院保藏；鱼露：大连工业大学水产品加工质量安全与控制重点实验室自行发酵；酸菜、大酱：市售。

氢氧化钠、碳酸氢钠、丹磺酰氯、草酸铵结晶紫、三丁酸甘油酯琼脂、β-苯乙胺、腐胺、组胺、精胺、亚精胺、红霉素、链霉素、链霉素、四环素、壮观霉素、克林霉素、卡那霉素、氨苄西林、甘油三丁酸酯、色胺、尸胺、酪胺（均为分析纯）：大连美仑生物试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Sigma 公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）、丙酮、氨水（均为分析纯）、脱脂乳粉（食品级）：上海生工生物工程股份有限公司；LB 肉汤、LB 琼脂、水解酪蛋白胨肉汤：青岛海博生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（GN1324）：上海民桥精密科学仪器有限公司；高效液相色谱仪（1260）：美国Agilent 公司；便携式电子鼻（PEN3）：德国Airsence 公司；紫外分光光度计（UV-1750）：日本岛津公司；pH 计（FE28）：上海Mettler Toledo 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株安全性评价

1.3.1.1 耐药性试验

耐药性试验在96 孔细胞培养板中进行，采用微量肉汤稀释法测定菌株的最低抑菌浓度[11]。8 种抗生素从常用的检测葡萄球菌抗生素敏感性的抗生素中选出。将每种抗生素的最小抑制浓度（minimal inhibitory concentration，MIC） 记录为在孔中未观察到混浊的最低浓度，进行5 次独立试验。

1.3.1.2 溶血性试验

溶血性测试[12]是将S.xylosus JCM 2418 在含有5%（体积分数）绵羊血的LB 琼脂板上划线，在37 ℃孵育48 h 后测定α-溶血性，然后在4 ℃放置24 h 测定β-溶血性。溶血性是通过观察每个LB 血平板上的菌落周围是否形成清晰的溶血区来确定的。Bacillus cereus用作阳性对照，进行5 次独立试验。

1.3.1.3 生物膜形成试验

根据Zhu 等[13]的方法，使用96 孔板法测定生物膜形成情况。无菌培养基作为阴性对照，金黄色葡萄球菌ATCC6538 作为阳性对照来分析生物膜形成情况。

1.3.2 菌株发酵性能鉴定

1.3.2.1 耐盐性能鉴定

在LB 肉汤培养基中添加不同浓度（1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%，质量浓度）的NaCl，配制不同盐浓度的培养基。菌液浑浊后（OD600nm=1.0），以1%（体积分数）接种量于37 ℃分别培养，观察其生长情况并记录。

1.3.2.2 蛋白酶活性试验

配制不同盐浓度（5%、10%、15%，质量浓度）的LB固体培养基，同时在培养基中加入2%（质量浓度）的脱脂乳粉，105 ℃灭菌5 min。以接种量为100 μL，37 ℃恒温培养箱培养5 d[14]。如果菌落周围有透明环，则证明菌株具有蛋白酶活性。

1.3.2.3 脂肪酶活性试验

配制不同盐浓度（5%、10%、15%，质量浓度）的三丁酸甘油酯琼脂培养基，121 ℃灭菌20 min 后，使培养基温度稳定在60 ℃左右，无菌条件下加入1%（体积分数）甘油三丁酸酯。以接种量为100 μL，37 ℃恒温培养箱培养5 d[14]。如果菌落周围有透明环，则证明菌株具有脂肪酶活性。

1.3.3 菌株生物胺降解相关酶类型及分布

1.3.3.1 生物胺降解相关酶活性鉴定

考察菌株中与生物胺降解相关酶——胺氧化酶和氨基酸脱羧酶是否存在，配制脱羧酶液体培养基[15]，孵育菌株，培养基变为紫色证明菌株具有氨基酸脱羧酶活性；如果培养基变成黄色，表明S.xylosus JCM 2418 可能具有胺氧化酶活性。

1.3.3.2 生物胺降解相关酶的分布

S.xylosus JCM 2418 在LB 液体培养基孵育，24 h后以6 000×g 转速离心10 min。取上清液作为细胞外组分；用4 ℃的PBS 洗涤菌体并均质，取一半菌液作为完整细胞组分；用研磨器研磨另一半菌液，在4 ℃条件下再次以6 000×g 转速离心10 min，收集上清液作为细胞内组分；沉淀用PBS 洗涤并均质，将其作为细胞膜组分。分别加入生物胺，使各生物胺的终浓度均为500 mg/L，培养48 h 后检测生物胺的含量[16]。

1.3.4 菌株在不同发酵食品中的应用

将菌液按3%的接种量接种至大酱、酸菜和鱼露中，发酵30 d，每5 d 取一次样品，对样品的生物胺降解率、pH 值以及风味进行检测。

1.3.4.1 生物胺降解率

根据Sang 等[17]的方法测量每个发酵食品样品中的总生物胺含量。将20 mL 10% TCA 添加到5 g 样品中混匀，获得样品生物胺提取液，进行衍生化后检测并计算。生物胺降解率计算公式如下。

式中：M 为生物胺降解率，%；A 和B 分别为对照组和接菌组生物胺含量，mg/kg。

1.3.4.2 pH 值称取5 g 样品，加入到45 mL 灭菌水中均质至样品均匀悬浮，用pH 计测定样品中的pH 值。

1.3.4.3 挥发性气味组分

使用便携式电子鼻在（23±2）℃下检测样品的特征风味。参考Ma 等[14]的方法，将精确量（10.0 g）的每个样品放入50 mL 离心管中进行风味检测。

1.4 数据分析

结果以平均值±标准差的形式表示，所有统计分析均基于重复试验3 次，使用SPSS 26 软件分析数据，采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，One-Way ANOVA）确定菌株之间的差异是否著，使用邓肯式多重比较在5%水平评估处理样品之间差异的显著性，以P＜0.05 表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 Staphylococcus xylosus JCM 2418 的安全性能评价

对抗生素的抗性是选择发酵剂安全性的主要考虑问题之一[18]。本研究对特定抗生素的耐药性是指被测抗生素的MIC 值高于欧洲抗菌药物敏感试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）定义的Enterococcus 属断点值。MIC高于断点的菌株被视为抗药性菌株[19]。除了抗生素敏感性外，还考虑了菌株的溶血活性和生物膜形成这两项指标。具有溶血活性的微生物菌株可能产生外毒素，例如链球菌溶血素，其可通过降解鞘磷脂完全溶解红细胞，导致人体缺血、缺氧，更严重的会导致昏厥和脑梗死[20]。

S.xylosus JCM 2418 的药敏性试验结果见表1。

表1 S.xylosus JCM 2418 的药敏性试验结果Table 1 Drug susceptibility testing results of S.xylosus JCM 2418

由表1 可知，菌株对每种抗生素敏感的最低浓度值均低于欧洲抗菌药物敏感试验委员会2020 年提供的断点值，S.xylosus JCM 2418 对通常用于检测葡萄球菌耐药性的抗生素敏感，表现出较弱的耐药性，因此，就抗生素敏感性而言，S.xylosus JCM 2418 可以被认为在发酵食品的应用上是安全的。

S.xylosus JCM 2418 的溶血性试验结果见图1。

图1 S.xylosus JCM 2418 的溶血性试验Fig.1 Hemolytic experiment of S.xylosus JCM 2418

从图1 中可以看出，一种已知的溶血性菌株蜡样芽胞杆菌在LB 琼脂上生长时，在菌落周围形成了非常清晰的区域，而S.xylosus JCM 2418 没有表现出溶血活性，分析S.xylosus JCM 2418 溶血活性的缺失可能会消除潜在的溶血风险。

另一种可能对发酵产品造成安全问题的主要因素是细菌的生物膜，生物膜是一种细菌自我保护的生长方式，病原菌和腐败菌可以附着在能够接触食物的固体表面上。这些细菌随后可能形成生物膜，生物膜将使细胞对清洁处理产生更强的抵抗力，并可能会在后续加工过程中污染其他食品[13]。这将促进细菌通过被污染的食品传播给消费者，最终导致人体被感染，生物膜被认为是细菌感染的常见来源[21]。根据试验结果，阴性对照组OD590nm平均值为0.168，标准偏差为0.012，S.xylosus JCM 2418 的OD590nm为0.136，通过生物膜成膜量的评判标准[22]计算，S.xylosus JCM 2418 没有生物膜产生，这表明将其用于发酵食品的生产是不具有风险的。

2.2 Staphylococcus xylosus JCM 2418 的发酵性能评价

S.xylosus JCM 2418 的耐盐性见图2。

图2 S.xylosus JCM 2418 的耐盐性Fig.2 Salt tolerance of S.xylosus JCM 2418

从图2 中可以看出，当培养基中NaCl 浓度达到20%时，菌株仍可以生长，但当菌株在25% NaCl 的培养基中培养时，菌种生长缓慢，可以认为菌株是一株耐盐菌，能够在高盐环境中生长繁殖。

不同盐浓度下S.xylosus JCM 2418 的发酵性能见图3。

图3 不同盐浓度下S.xylosus JCM 2418 的发酵性能Fig.3 Fermentation performance of S.xylosus JCM 2418 under different salt concentrations

从图3A 中可以看出，S.xylosus JCM 2418 菌落周围有透明圈，说明其具有蛋白酶活性，且随着盐浓度的增加，蛋白酶活性呈下降趋势，说明它具有发酵鱼露、虾酱、香肠等高蛋白食品的能力[23]。从图3B 中可以看出，S.xylosus JCM 2418 菌落周围也有透明圈，说明其具有脂肪酶活性，且盐浓度对菌株的脂肪酶活性影响不大，这表示它可以作为高脂肪食品的发酵剂。

2.3 Staphylococcus xylosus JCM 2418 的生物胺降解相关酶初步研究

生物胺的积累主要是有两方面原因，一方面是氨基酸脱羧酶发挥作用，促进生物胺的产生，另一方面是胺氧化酶对生物胺的氧化作用，使生物胺分解代谢[15]。据报道胺氧化酶主要分布在细胞膜或细胞质上[22]，为了确定S.xylosus JCM 2418 的胺氧化酶所处的位置，本研究对S.xylosus JCM 2418 培养后的不同组分进行了处理，并分别与其完整细胞的生物胺降解能力进行比较。

生物胺降解相关酶类型及分布见图4。

图4 生物胺降解相关酶类型及分布Fig.4 Types and distribution of biogenic amine degrading enzymes

从图4A 中可以看出，S.xylosus JCM 2418 的氨基酸脱羧酶试验结果显色反应呈黄色，所以S.xylosus JCM 2418 具有胺氧化酶活性，可能不具有氨基酸脱羧酶活性，说明在食品发酵过程中可能不会导致生物胺的积累，并且可能具有降解生物胺的能力；从图4B 中可以看出，S.xylosus JCM 2418 在细胞内、外两个组别中生物胺降解率均低于3%，说明在这两个位置胺氧化酶活性并不高，而在细胞膜和完整细胞这两个组别中显示出对生物胺较高的降解能力，但是细胞膜中的生物胺降解率稍低于完整细胞，导致这一情况的原因可能归结于在破碎过程中造成了部分胺氧化酶的失活。因此，可以得出S.xylosus JCM 2418 的胺氧化酶主要位于其细胞膜上。

2.4 Staphylococcus xylosus JCM 2418 的应用潜力

2.4.1 Staphylococcus xylosus JCM 2418 对发酵食品中生物胺降解率的影响

控制发酵食品中生物胺的含量对于生产优质安全的产品非常重要。接种S.xylosus JCM 2418 可以有效减少发酵期间这些生物胺的积累。

S.xylosus JCM 2418 对发酵食品中生物胺的降解能力见图5。

图5 S.xylosus JCM 2418 对发酵食品中生物胺的降解能力Fig.5 Ability of S.xylosus JCM 2418 to degrade biogenic amines in fermented food

从图5 中可以看出，对于大酱来说，对腐胺、亚精胺和精胺的降解率分别可以达到59.9%、61.8%和43.9%；对于酸菜来说，对腐胺、尸胺和组胺的降解率分别可以达到30.4%、28.3%和31.1%；对于鱼露来说，对色胺、腐胺和酪胺的降解率分别可以达到43.7%、36.2%和30.2%。通过以上数据表明发酵剂S.xylosus JCM 2418 可以有效抑制发酵食品中生物胺的积累。

发酵30 d 后，接种S.xylosus JCM 2418 对生物胺的降低能力仍起作用。以鱼露为例，接种S.xylosus JCM 2418 后，可以延缓鱼露中腐胺降解率下降的速度；而且其中组胺的降解情况随着腐胺的改变规律改变，在发酵15 d 时组胺和腐胺的降解率均达到最高。组胺毒性的高低与尸胺、腐胺等其它胺类的吸收浓度和存在情况有关。过量摄入组胺可能会导致头痛和高血压等症状[24]。根据图5 数据，可以看出接种S.xylosus JCM 2418 后，这3 种发酵食品中组胺的降解率最高可达30%，整个发酵过程中组胺降低能力较好，尤其是酸菜，在发酵30 d 后组胺降解率仍可达20%，其它两种发酵食品中组胺降解率在15%左右，说明添加发酵剂S.xylosus JCM 2418 可以有效抑制组胺的积累，间接控制了生物胺过量带来的食品安全风险。

2.4.2 Staphylococcus xylosus JCM 2418 对发酵食品中pH 值的影响

在发酵食品中，不同种类乳酸菌产生的乳酸和乙酸导致pH 值降低，而代谢物和挥发性化合物的形成使pH 值升高。发酵早期阶段的各种代谢物的产生可能是pH 值波动的原因。随着发酵进行，pH 值渐渐处于降低或平稳状态的趋势，这可能主要由于氨和胺等碱性含氮物质显著降低所致[25]。

S.xylosus JCM 2418 对发酵食品pH 值的改变见图6。

图6 S.xylosus JCM 2418 对发酵食品pH 值的改变Fig.6 Changes of pH of fermented foods by S.xylosus JCM 2418

从图6 中可以看出，pH 值随着发酵进行逐渐降低并趋于平稳，与对照组相比，试验组的pH 值下降幅度更大。已知较低的pH 值能有利于生产优质安全的食品[26]。高pH 值可能表明产品已经变质，并且可能已经产生了一些有害物质，由此可知，S.xylosus JCM 2418的接种有利于提高食品安全性。

2.4.3 Staphylococcus xylosus JCM 2418 对发酵食品中风味的影响

应用电子鼻中的金属氧化物半导体传感器，通过模拟人体嗅觉系统来区分发酵食品的风味特征。近年来，应用发酵剂改善发酵食品风味的报道屡见不鲜。Zhou 等[27]的研究评估了乳酸菌对低盐发酵鲭鱼调味料理化特性的影响，乳酸菌发酵鲭鱼调味料的风味优于传统鱼露。

S.xylosus JCM 2418 对发酵食品风味的改变见图7。

图7 S.xylosus JCM 2418 对发酵食品风味的改变Fig.7 Changes of the flavor of fermented food by S.xylosus JCM 2418

从图7 中可以看出，W1S、W1W、W2W 和W5S 4个传感器分别监测到的甲基类、硫化物、醇类以及氮氧化合物对3 种发酵产品的风味贡献最大，大酱和酸菜样品中也检测到有机硫化物的贡献，鱼露样品中还检测到苯类化合物的贡献，该结果已得到先前报道的证实[28]。与此同时，可以直观地看到大酱和鱼露发酵过程中整体的风味物质变化是先增加后趋于稳定，酸菜发酵过程中整体的风味物质变化是先增加后减少。

含氮含硫类化合物是发酵食品中主要的挥发性风味物质之一，主要呈蔬菜香、洋葱香等[29]；吡嗪类物质是酱的特征性风味物质，呈现的主要是肉香味和烤香味[30]。含氮含硫类化合物是发酵食品中种类最多含量最高，且随发酵变化明显的化合物，从一定程度上影响着最终产品的风味。醇类化合物的阈值通常较高，醇类主要是通过脂质氧化而产生的，随着发酵的进行醇类化合物一般具有芳香、植物香、酸败和土霉味。荣良燕等[31]发现，与商业发酵剂相比，木糖葡萄球菌和副干酪乳杆菌组合发酵的香肠总体可接受性相对较高，且庚醛、1-辛烯-3-醇等愉悦风味物质为该组独有，表现出更加浓郁甜香味。所以，根据电子鼻的检测结果，可以认为S.xylosus JCM 2418 的接种使发酵食品的含硫含氮类以及醇类化合物的挥发性成分含量升高，使发酵食品的味道更浓郁。

3 结论

Staphylococcus xylosus JCM 2418 是一株相对安全的革兰氏阳性菌，具有蛋白质水解能力和脂肪水解能力，可以在20% NaCl 的浓度环境中生长。因此，具有应用到高盐高蛋白发酵食品中的潜力。将S.xylosus JCM 2418 应用到大酱、酸菜和鱼露中，pH 值均呈降低的趋势；风味呈增强的趋势，S.xylosus JCM 2418 的接种可以使发酵食品具有更浓郁的味道。在大酱中，腐胺、亚精胺和精胺的降解率分别可以达到59.9%、61.8%和43.9%；在酸菜中，腐胺、尸胺和组胺的降解率分别可以达到30.4%、28.3%和31.1%；在鱼露中，色胺、腐胺和酪胺的降解率分别可以达到43.7%、36.2%和30.2%。以上可以说明，S.xylosus JCM 2418 的接种可以减少发酵食品中由于过量生物胺的积累引发的食品风险。后续将结合基因方面的试验对S.xylosus JCM 2418 降解生物胺的机制进行更深入的研究。