绞股蓝茯砖茶代谢物特征及其体外降血脂作用

邬培鸿，曹时玲，高悦华，成欣，夏飞

（陕西科技大学 食品科学与工程学院，陕西 西安 710021）

茯砖茶是以黑毛茶为原料，经过筛选、拼配、汽蒸、渥堆、压制定型、发花、干燥和成品检验等工序制成的后发酵茶[1-3]。在茯砖茶加工过程中，通过水热和茯砖茶特有的冠突曲霉（Aspergillus cristatus）的作用，可将黑毛茶中大分子物质逐步转化为小分子物质，进而形成茯砖茶醇厚滋味的物质基础。研究发现，茯砖茶具有降血糖[4]、抗氧化[5]、促进肠道健康[6]等功能。随着人们对自身健康的关注，茯砖茶越来越受到关注。目前有关茯砖茶的研究主要集中在微生物群落分析[2]、代谢物组成[3]、茯砖茶品质形成机制研究[7]以及新产品开发[8-10]等方面。市场上茯砖茶种类较为单一，主要以传统茯砖茶为主。为丰富茯砖茶产品种类，推动茯砖茶产业快速发展，有必要开发多样化功能茯砖茶产品。

绞股蓝是一种葫芦科草质藤本植物，又称小苦药、七叶胆等，具有显著的调节血脂的功能[11-13]。目前已有一些功能性的绞股蓝茶、绞股蓝酒、绞股蓝口服液等产品[14]，其中以绞股蓝茶所占比例较高。然而绞股蓝茶口感苦涩，不利于大众接受。利用茯砖茶中关键微生物A.cristatus 对绞股蓝进行发酵，有望改善绞股蓝苦涩的口感，同时获得具有降血脂作用的功能性茯砖茶。目前，已有报道的复配型茯砖茶有杜仲茯茶[8]、桑叶茯茶[9]、罗布麻茯茶[9]等，而有关绞股蓝茯砖茶及其调节血脂功能的报道还较少。

为改善绞股蓝茶口感，开发具有多种功能的茯砖茶品类，本研究制备绞股蓝茯砖茶，进而对绞股蓝茯砖茶主要物质成分进行探究；并利用液相色谱质谱联用仪对绞股蓝茯砖茶代谢产物以及其形成的代谢通路进行分析；最后通过体外试验评估绞股蓝茯砖茶的降脂功效，以期为功能性茯砖茶的开发和应用提供依据，为丰富茯砖茶产品市场提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三四级黑毛茶、绞股蓝：市售；98%浓硫酸（分析纯）：西安化学试剂厂；95%乙醇、无水乙醇、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、醋酸钾、碳酸钠（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；水合茚三酮（分析纯）、芦丁（标准品）、没食子酸（标准品）、福林酚（分析纯）、胰酶（生物试剂）、辛伐他汀（97%）、甘胺胆酸钠（98%）、胆酸钠（生物试剂）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇（分析纯）：天津市登峰化学试剂厂；蒽酮（分析纯）：郑州派尼化学试剂厂；甲醇、甲酸、丙醇（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氢二钠（分析纯）、乙腈（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；牛磺胆酸钠（95%）、阿卡波糖水合物（98%）、α-淀粉酶（50 U/mg）；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

人工气候培养箱（LRH-400-GS）：广东省医疗器械有限公司；紫外可见分光光度计（SP-756PC）：上海光谱仪器有限公司；恒温振荡器（HZQ-F160A）：上海一恒科技有限公司；电热鼓风干燥箱（101-2 型）：北京科伟永兴仪器有限公司；电子天平（BS2245）：德国赛多利斯公司；电热恒温水浴锅（8002 型）：北京化玻联医疗器械有限公司；组织研磨仪（CBGT-48）、酶标仪（Multiskan GO）、超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-Q Exactive）：赛默飞世尔科技公司；色谱柱（HSS T3）：美国Waters 公司；氮气吹扫仪（JXDC-20）：上海净信实业发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 绞股蓝茯砖茶的制备

将绞股蓝与黑毛茶以10%原料比拼配，调整水分含量为22%左右，汽蒸15 min，渥堆发酵16 h，发花13 d，制备绞股蓝茯砖茶（gynostemma pentaphyllum Fu brick tea，GFT），同时制备传统茯砖茶（Fu brick tea，FT）作为对照，每种茯砖茶样品平行6 组。

1.3.2 绞股蓝茯砖茶中活性成分测定

绞股蓝茯砖茶的水浸出物含量参照GB/T 8305—2013《茶水浸出物测定》进行测定；茶多糖采用蒽酮-硫酸比色法[15]；茶多酚总量参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》进行测定；金花菌数量参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行测定。

1.3.3 基于液相色谱质谱联用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS） 对绞股蓝茯砖茶与茯茶的代谢产物分析

1.3.3.1 代谢物提取

分别取10 mg 的绞股蓝茯砖茶（GFT）和茯砖茶（FT）样本于2 mL 离心管中，加入一颗直径6 mm 的研磨珠，400 μL 甲醇∶水=4∶1（体积比）进行代谢产物提取。样本溶液于冷冻组织研磨仪研磨6 min（-10 ℃，50 Hz），然后低温超声辅助提取30 min（5 ℃，40 kHz）。将样品于-20 ℃下静置30 min，随后离心15 min（4 ℃，13 000×g），移取上清液上机分析。另取等量样品混合成质量控制样（quality control sample，QC）上机检测。

1.3.3.2 LC-MS 分析

色谱条件：2 μL 样本经高速液相色谱T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）分离后进入质谱检测。流动相A 为95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流动相B 为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水（含0.1%甲酸）。分离梯度：0～0.1 min，流动相B 0%～5%；0.1～2 min，流动相B 5%～25%；2～9 min，流动相B 25%～100%；9～13 min，流动相B 维持100%；13.0～13.1 min，流动相B 线性从100%降至0%；13.1～16 min，流动相B 维持0%。流速设置为0.40 mL/min，柱温40 ℃。

质谱条件：样品质谱信号采集采用正负离子扫描模式，质量扫描范围m/z 70～1 050。离子喷雾电压，正离子电压3 500 V，负离子电压2 800 V，鞘气275.79 kPa，辅助加热气68.95 kPa，离子源加热温度400 ℃，一级质谱（mass spectrometry 1，MS1）分辨率70 000，二级质谱（mass spectrometry 2，MS2）分辨率17 500。

1.3.3.3 数据预处理

将LC-MS 原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI（waters corporation，milford，USA）进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵。同时将质谱（mass spectrometry，MS） 和串联质谱（tandemmass spectrometry，MS/MS） 信息与代谢公共数据库（http：//www.hmdb.ca/）进行匹配，得到代谢物信息。

1.3.3.4 差异代谢物分析

对预处理后的矩阵文件进行差异分析。利用主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交最小偏二乘判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA），并使用7 次循环交互验证评估模型的稳定性。此外，进行Student’s T 检验和差异倍数分析。差异代谢物的选择基于OPLS-DA模型得到的变量权重值（variable important in projection，VIP）和Student’s T 检验P 值来确定，VIP＞2.0，P＜0.05 的代谢物为差异代谢物。差异代谢物通过KEGG数据库（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）进行代谢通路注释，获得差异代谢物参与的通路。

1.3.4 绞股蓝茯砖茶体外降血脂活性测定

1.3.4.1 GFT 茶汤浓缩液制备

取100 g 绞股蓝茯砖茶，加入1 L 90 ℃的水浸泡30 min。将浸提的1 L 茶汤旋转蒸发浓缩至0.2 L，随后将浓缩液冷冻干燥，得绞股蓝茯砖茶茶汤冻干粉[16-17]。称取2 g 茶汤冻干粉加入200 mL 蒸馏水中制备10 mg/mL的GFT 茶汤浓缩液母液，备用。

1.3.4.2 茶汤浓缩液体外降血脂活性

参照文献[18]的方法略作修改。分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的GFT 茶汤浓缩液1.0 mL 于10 mL具塞试管中，分别加入1.0 mL 0.01 mol/L 的盐酸溶液，在37 ℃恒温振荡消化30 min，以0.1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 值至6.24，随后分别加入4.0 mL 10 mg/mL胰酶，再37 ℃恒温振荡消化30 min。分别向每个样品中加入4 mL 1.0 mmol/mL 的牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠和胆酸钠溶液（均以pH6.24 的0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制），每种胆酸钠盐重复3 次，37 ℃恒温振荡1 h 后将混合物转入离心管，4 000 r/min 离心20 min。对上清液中的胆酸盐含量进行分析[18-20]，以辛伐他汀代替胆酸钠盐作为阳性对照。

1.3.5 绞股蓝茯砖茶体外降血糖活性测定

1.3.5.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

参照阿卡波糖比色法[21]测定，依次加入40 μL 不同浓度GFT 茶汤浓缩液、80 μL 10 mmol/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液于96 孔板中，37 ℃孵育5 min，随后加入40 μL 对硝基苯β-D-葡萄糖苷溶液（2 mmol/L），37 ℃反应30 min，随后加入80 μL Na2CO3溶液，终止反应，于酶标仪中检测405 nm 处的吸光度。

1.3.5.2 α-淀粉酶抑制活性的测定

参照阿卡波糖比色法[21-22]测定，将0.5 mL 浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 的GFT 茶汤浓缩液分别与0.5 mL α-淀粉酶溶液（0.5 mg/mL）和0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH6.8 且含有0.006 mol/L NaCI）混匀。将溶液室温下反应10 min 后添加0.01 g/mL 淀粉溶液，室温下反应10 min，再加入1 mL 3，5-二硝基水杨酸显色，沸水浴中反应5 min，冰水浴冷却，加入10 mL 去离子水后，于540 nm 波长处测定吸光度。以阿卡波糖作为阳性对照，同时进行分析。

1.4 数据处理

采用Origin 2021 软件作图，SPSS 27 软件对试验数据进行显著性分析。数值采用平均值±标准差表示。P＜0.05 表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝茯砖茶的活性成分

绞股蓝茯砖茶和茯砖茶中活性成分如表1 所示。

表1 绞股蓝茯砖茶和茯砖茶的各物质含量Table 1 The content of each substance of GFT and FT

由表1 可知，绞股蓝茯砖茶与茯砖茶相比，茶多糖增加了143.17 mg/g，茶多酚增加了131.58 mg/g，绞股蓝茯砖茶中茶多糖、茶多酚以及游离氨基酸含量均显著高于传统茯砖茶（P＜0.05）。这可能是由于鲜嫩的绞股蓝叶中多糖类、多酚类物质含量高，这为绞股蓝茯砖茶的茶汤具有抗氧化和养生功效提供物质基础[23-24]。而茯砖茶和绞股蓝茯砖茶中干物质含量，可以提升茶汤的口感和香气[25]。

2.2 绞股蓝茯砖茶和茯砖茶代谢组分析

2.2.1 绞股蓝茯砖茶和茯砖茶代谢物组成分析

绞股蓝茯砖茶和茯砖茶代谢物组成分析如图1所示。

图1 绞股蓝茯砖茶和茯砖茶样本正离子模式的主成分得分图和OPLS-DA 模型得分图Fig.1 Principal component score diagram and OPLS-DA model score diagram of positive ion mode of GFT and FT samples

由图1a 可知，PC1 和PC2 解释量之和为74.70%；负离子模式下，数据结果的PCA 分析的PC1 和PC2解释量之和为76.9%（数据未展示）。表明两种模式采集的代谢组数据通过PCA 分析均能较好说明数据的整体情况。PCA 图谱中，QC 聚集度较高，FT 和GFT 的6 个平行重复良好，表明代谢组检测方法以及系统稳定可靠。GFT 和FT 的6 个平行各自聚集且相互明显分开，表明绞股蓝茯砖茶和茯砖茶样品中代谢产物存在明显的差异性。

由图1b 可知，正离子模式下的OPLS-DA 模型对绞股蓝茯砖茶和茯砖茶代谢组数据集的解释度为70.11%，负离子模式下OPLS-DA 模型对绞股蓝茯砖茶和茯茶代谢组数据集的解释度为76.20%（数据未展示）。GFT 和FT 样品区分非常显著，样本全部处于95%置信区间内，表明绞股蓝茯砖茶与茯砖茶的代谢物存在明显差异，可用于后续差异成分分析。

2.2.2 绞股蓝茯砖茶和茯砖茶的差异性代谢物筛选及分析

对绞股蓝茯砖茶和茯砖茶的代谢产物进行比较，共检测出显著差异代谢物10 类142 种（VIP＞2.0 且P＜0.05），绞股蓝茯砖茶和茯砖茶的差异代谢物种类如表2 所示。然后选取绞股蓝茯砖茶（GFT）和茯砖茶（FT）之间差异明显的前30 种代谢产物（VIP＞3.2，P＜0.05），进行差异代谢的热图分析，绞股蓝茯砖茶和茯砖茶的差异代谢物如图2 所示。

图2 绞股蓝茯砖茶和茯砖茶差异代谢的热图Fig.2 Heat map of differential metabolism of GFT and FT

表2 绞股蓝茯砖茶较茯砖茶差异性代谢物种类与变化情况Table 2 Differential metabolic species and changes of GFT and FT

由表2 可知，这些差异代谢物主要包括脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物、苯丙烷和聚酮类、有机氧化合物、苯环型化合物、核苷酸和类似物、生物碱及其衍生物、有机氮化合物10 个类别。GFT 与FT 相比，其中显著上调的差异代谢物有90种，显著下调的差异代谢物有52 种，且脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物等物质占有较高比例。

由图2 可知，前30 种差异明显的代谢产物中，与FT 相比，GFT 中显著上调的代谢物包括4-香豆酰氯（4-coumaroylputrescine，VIP=4.13）、黄绿青霉素（citreoviridin，VIP =3.43）、 洛 加诺 西 甙（loganoside，VIP =3.44）、全反式-13，14-二氢视黄醇（all-trans-13，14-dihydroretinol，VIP=3.93）、越南参皂苷R12（vinaginsenoside R12，VIP=3.3）、N-羟基-L-酪氨酸（n-hydroxy-L-tyrosine，VIP=3.98）、脱氢丁烯（dehydrotremetone，VIP=3.58）、肉桂萜醇D1（cinncassiol D1，VIP=3.75）、吡拉西坦（piracetam，VIP=4.43），人参皂苷Rh8（ginsenoside Rh8，VIP=3.35）、二甲醚（dimethisterone，VIP=3.31）、N-乙酰-D-半胱氨酸（n-acetyl-D-cysteine，VIP=3.41）、去氢大豆皂甙I（dehydrosoyasaponin I，VIP=3.83）等。这些代谢物可能是绞股蓝茯砖茶中特有的代谢产物，为绞股蓝茯砖茶的特殊功能奠定物质基础。

2.2.3 差异性代谢物的通路分析

为确定GFT 与FT 差异代谢物的产生代谢途径，对表2 中的差异代谢物根据KEGG 数据库进行通路富集分析，通路富集结果如图3、表3 所示。

图3 绞股蓝茯砖茶差异性代谢产物的KEGG 富集气泡图Fig.3 Bubble diagram of KEGG enrichment of differential metabolism from GFT and FT

表3 绞股蓝茯砖茶特征性代谢产物形成通路Table 3 Characteristic metabolite formation pathway of GFT

由图3 可知，GFT 与FT 的差异性代谢物主要集中在脂类代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢等方面。图3 中Y 轴代表GFT 与FT 差异代谢物的通路富集，X 轴代表通路影响。富集气泡尺寸越大和颜色越深分别代表GFT 和FT 中更大的通路富集和更高的通路影响值。其中，孕烯醇酮、2-羟基雌酮等是绞股蓝茯砖茶中重要脂类的差异性代谢产物，具有重要影响。石胆酸葡糖苷酸（lithocholic acid glucuronide）、D-葡萄糖酸（D-glucuronic acid 1-phosphate）、反式乌头酸（trans-aconitic acid） 等是绞股蓝茯砖茶中重要的碳水化合物类差异性代谢产物。氨基酸代谢通路中，L-组氨酸（Lhistidine）、L-喹啉酯（L-quinate）、5'-甲基硫代腺苷（5'-methylthioadenosine）是绞股蓝茯砖茶中重要的氨基酸类代谢产物（表3）。整体上，氨基酸代谢和碳水化合物代谢对绞股蓝茯砖茶中代谢产物的形成影响较大。

2.3 绞股蓝茯砖茶体外降血脂、降血糖体外活性测定结果

2.3.1 GFT 茶汤浓缩液体外降血脂测定结果

GFT 茶汤浓缩液对牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠和胆酸钠活性的影响如图4 所示。

图4 GFT 茶汤浓缩液的体外降血脂活性Fig 4 In vitro hypolipidemic activity of GFT tea soup concentrate

由图4 可知，随着浓度的增加，GFT 茶汤浓缩液与牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠和胆酸钠的结合率也在增加。0.2 mg/mL GFT 茶汤浓缩液与牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠的结合率分别是阳性对照（辛伐他汀）的18.06%、18.05%、30.56%。0.6 mg/mL GFT 茶汤浓缩液与牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠的结合率分别是阳性对照的17.67%、17.67%、31.26%。GFT 茶汤浓缩溶液的浓度为1.0 mg/mL 时，其对牛磺胆酸钠的结合率为14.65%，对甘氨胆酸钠的结合率为17.43%，对胆酸钠的结合率为34.1%。1.0 mg/mL GFT 茶汤浓缩液与牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠的结合率是阳性对照的17.88%、17.88%、36.52%。GFT 茶汤浓缩液与3 种胆酸钠的结合量越高，说明其降胆固醇效果越好，降血脂活性越强。本研究中GFT 茶汤浓缩液的体外降脂效果是辛伐他汀药物的17.88%～36.52%。然而，绞股蓝茯砖茶作为一种茶饮品，在安全性等方面具有明显优势，可长期饮用此类茶来调节血脂。

2.3.2 GFT 茶汤浓缩液体外降血糖测定结果

GFT 茶汤浓缩液对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的影响如图5 所示。

图5 GFT 茶汤浓缩液的体外降血糖活性Fig.5 In vitro hypoglycemic activity of GFT tea soup concentrate

由图5 可知，GFT 茶汤浓缩液具有α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，随着茶汤冻干粉浓度的增加，其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率也在增加。0.6 mg/mL GFT 茶汤浓缩液对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率是阳性对照（阿卡波糖） 的12.31%、44.54%。1.0 mg/mL GFT 茶汤浓缩液对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率分别为8.23%和42.64%，分别是阳性对照的13.63%、58.18%。绞股蓝茯砖茶具有长期用于食疗调整高血糖症的潜力。

3 结论

本研究对绞股蓝茯砖茶中的代谢产物特征进行分析，探讨差异性代谢产物的形成代谢通路，并初步揭示了绞股蓝茯砖茶的体外降血脂和降血糖活性。与传统茯砖茶相比，绞股蓝茯砖茶中共有10 类142 种显著性差异代谢产物，包括38 种脂质和类脂分子、29 种有机酸及其衍生物、19 种有机杂环化合物和15 种苯丙烷和聚酮类等。绞股蓝茯砖茶差异性代谢物主要集中在脂类代谢通路、碳水化合物代谢通路、氨基酸代谢通路等方面。绞股蓝茯砖茶具有一定的体外降血脂和降血糖活性，可长期用于食疗调整高血脂、高血糖症。本研究旨在开发功能性茯砖茶产品，以期为茯茶产业多元化发展提供理论基础。