高效液相色谱-三重四极杆质谱用于食品中9 种甜味剂的分析

杨天明，叶磊海，钟世欢，黄 南，陆梅阳，徐聪玲，苏 敏，项睿洁，王 辉

（浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009）

随着越来越多的食品种类的出现，高甜度、低热量的各种甜味剂在食品添加剂中的作用也越来越大。天然甜味剂在人体使用后基本无明显毒副作用，而人工合成甜味剂由于主要通过各种化学反应来合成的磺胺类甜味剂、二肽类甜味剂和蔗糖衍生物类甜味剂，其使用成本更低、甜度更高，所以部分食品加工厂家会使用人工合成甜味剂来调整食品的口味，由于不易被人体代谢吸收，食用多了会增加肝脏的负担和损伤神经系统。我国发布的《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中如今已经明确规定了各类甜味剂的使用范围[1]。

现行的国家标准对食品中甜蜜素（环已基氨基磺酸钠）、糖精钠、三氯蔗糖、安赛蜜、纽甜、阿斯巴甜、阿力甜、甜菊糖苷和甜菊双糖苷9 种甜味剂的检测方法比较少，目前的现有检测方法主要以单项目标物高效液相色谱法为主[2-9]。由于9 种甜味剂每个方法检测条件都有所不同，如果同时使用高效液相色谱法进行检测的话，杂峰的干扰会很大，出现各个目标物无法进行分离，从而无法做到用同一个高效液相色谱法来检测9 种甜味剂。

试验建立了采用高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定食品中的9 种甜味剂的方法[12-20]。与现有的国家标准检测方法相比较，该方法操作简单、高效，具有分辨率高、分离度好、高灵敏度等优点，可对食品中9 种甜味剂进行确证，提高了样品的检测效率。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 型超高效液相色谱-6495 三重四极杆质谱仪，美国Agilent 公司产品；QUINTIX65 型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；AR2140型电子分析天平，常州奥豪斯仪器有限公司产品；KS-300EI 型超声波清洗器，宁波海曙科生超声设备公司产品；Milli-Q 型纯水仪，美国Millpore 公司产品。

乙腈，色谱纯；甲酸，色谱纯；甜蜜素（环已基氨基磺酸钠）、糖精钠、三氯蔗糖、纽甜、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜、甜菊糖苷、甜菊双糖苷9 种标准品，国家标准物质中心提供（纯度均大于99.0%）。

1.2 试验条件

1.2.1 标准溶液配制

分别称取上述标准品用超纯水溶解，分别配制为质量浓度为100 μg/mL 的标准储备溶液，于4 ℃避光环境下保存。分别量取甜蜜素（环已基氨基磺酸钠）、纽甜、糖精钠、阿斯巴甜、阿力甜、安赛蜜各1.0 mL加入到100 mL 容量瓶中，用纯化水定容到刻度，配制成为质量浓度1 μg/mL 的标准中间液混标，分别量取甜菊糖苷、甜菊双糖苷、三氯蔗糖各1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用纯化水定容到刻度，配制成为质量浓度为10 μg/mL 的标准中间液混标。分别量取适量于10.00 mL 容量瓶中，用纯化水定容到刻度，配制成甜蜜素（环已基氨基磺酸钠）、纽甜、糖精钠、阿斯巴甜、阿力甜、安赛蜜质量浓度为10.0～200.0 ng/mL，三氯蔗糖、甜菊糖苷、甜菊双糖苷质量浓度为20.0～2 000.0 ng/mL 的混合标准工作溶液（现配现用）。

1.2.2 样品前处理

准确称取饮料、八宝粥和面包样品2 g（精确至0.01 mg）至50.00 mL 容量瓶中，加纯化水30.0 mL，超声仪超声提取30 min，定容至刻度，经0.22 μm滤膜过滤后供LC/MS 检测。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱，4.6 mm×150 mm，3.5 μm，柱温35 ℃，进样量5 μL，流动相A：0.2%甲酸水溶液，流动相B：纯乙腈，流速0.25 mL/min。

液相色谱梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件 / %

1.2.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI+-）；检测方式：多反应离子监测模式（MRM）。

9 种甜味剂的质谱参数见表2。

气帘气压力25 psi，碰撞气流6 mL/min，离子化电压-4 500 V，离子源温度500 ℃，雾化器压力50 psi，辅助气压力50 psi，入口电压-10.0 V，出口电压-10.0 V。

2 结果与分析

2.1 样品提取程度

分别对阴性空白样品饮料、八宝粥、面包3 类样品进行加标，取样量为2 g 分别于10，25，50，100 mL 容量瓶中，分别加纯化水5，15，30，60 mL，涡旋1 min，超声波提取30 min，定容至刻度，摇匀，转移到50 mL 离心管中，以转速4 000 r/min 离心后过0.22 μm 微孔滤膜后上机进样。比较不同定容体积下的提取程度。结果表明，饮料在不同定容体积下对9 种甜味剂的提取程度基本一致；八宝粥和面包在50 mL 定容体积下的提取程度最高，故最终样品选择使用50 mL 容量瓶进行定容提取。

2.2 色谱柱的优化

选择了实验室中现有的Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）和WATERS Xbridge shield RPC18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）2 种色谱柱对9 种甜味剂的分离效果。结果表明，当使用Agilent ZORBAX SB-C18柱时，甜菊双糖苷、甜菊糖苷和纽甜3 种甜味剂的分离度较差。而使用WATERS Xbridge shield RPC18柱时，三氯蔗糖、阿力甜、纽甜、甜菊双糖苷和甜菊糖苷5 种甜味剂的分离度较差。对比试验结果，最终选择使用Agilent ZORBAX SB-C18柱。

采用Agilent ZORBAX SB-C18柱总离子色谱图见图1，采用WATERS Xbridge shield RPC18柱总离子色谱图见图2。

图1 采用Agilent ZORBAX SB-C18 柱总离子色谱图

图2 采用WATERS Xbridge shield RPC18 柱总离子色谱图

2.3 流动相的选择

对流动相的选择也进行了考查，首先在有机相的选择中发现乙腈比甲醇对甜味剂的响应灵敏度更高。其次分别考查了采用乙腈-纯化水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈-0.2%甲酸水时对9 种甜味剂的分离效果和灵敏度。采用纯乙腈-5 mmol/L 乙酸铵水溶液时，9 种甜味剂的色谱峰较宽，而且部分峰型存在拖尾情况，甜菊糖苷、甜菊双糖苷和纽甜3 种甜味剂的分离效果一般，其余6 种甜味剂的分离度和色谱峰的情况较好；采用乙腈-纯化水时，9 种甜味剂的分离度较差，只出现了3 组峰型重合在一起；而采用乙腈-0.2%甲酸水时，9 种甜味剂的色谱峰峰型和分离度比较乙腈-5 mmol/L 乙酸铵水溶液时更好。故试验最终选择乙腈-0.2%甲酸水为流动相。

2.4 质谱条件的优化

比较了9 种甜味剂在正离子和负离子的模式下的响应值，最终选择除甜蜜素之外的8 种甜味剂为负离子模式，而甜蜜素选择正负离子同时进行扫描的模式。首先对9 种甜味剂进行了一级质谱分析，得到了9 种甜味剂的母离子质量数，并且对去簇电压进行优化，保证了母离子的传输效率；将母离子进行碰撞后，对9 种甜味剂进行二级质谱分析，得到9 种甜味剂子离子质谱图，对碰撞能进行了优化，在多反应监测（MRM）模式下对优化好的去簇电压和碰撞能进行测试，并在此过程中不断优化毛细管电压、干燥器温度、雾化器的压力和流速等质谱参数，使离子化效率达到最佳值。

MRM 多反应监测模式下各离子色谱图见图3。

图3 MRM 多反应监测模式下各离子色谱图

2.5 线性关系和检出限的考查

在所优化的色谱条件和质谱条件下，以优化后的流动相对9 种甜味剂进行测定，用阴性样品的空白基质配制成一系列适度浓度的标准曲线，以目标物质量浓度结果为横坐标（X），对应响应值结果为纵坐标（Y），进行线性回归，通过向阴性空白样品中添加标准目标物来考查方法的检出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）、线性回归方程、线性关系、检出限、定量限和线性范围。

9 种甜味剂的线性方程和相关系数见表3。

表3 9 种甜味剂的线性方程和相关系数

2.6 方法回收率和精密度验证

分别对饮料、八宝粥和面包阴性空白样品分别进行3 个质量浓度6 次加标回收试验考查回收率和精密度，在线性范围内，分别选择0.50，1.00，3.00 mg/kg 和1.00，2.00，6.00 mg/kg 进行添加回收试验，最终得到该方法的方法回收率和精密度。

食品中9 种甜味剂的回收率和精密度见表4。

表4 食品中9 种甜味剂的回收率和精密度

3 个质量浓度水平下9 种甜味剂在饮料、八宝粥和面包中的平均加标回收率为81.4%～105.3%，相对标准偏差为1.2%～4.1%。该方法具有较高的准确度和精密度。

2.7 实际样品的测定

选取了市售的不同品牌的饮料、八宝粥和面包各10 批进行9 种甜味剂的测定，发现10 批饮料中有6 批含有安赛蜜，10 批八宝粥有9 批含有安赛蜜，含量均在0.30 g/kg 标准值以下；10 批饮料中有5 批含有阿斯巴甜，含量均在0.60 g/kg 标准值以下；10 批饮料中有5 批含有三氯蔗糖，10 批八宝粥有8 批含有三氯蔗糖，含量均在0.25 g/kg 标准值以下，其余甜味剂均未检出，可以与标签的配料表上所标识的配料匹配。面包中均未检出9 种甜味剂。

3 结论

建立了高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定食品中甜蜜素（环已基氨基磺酸钠）、三氯蔗糖、阿力甜、安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、甜菊糖苷、纽甜、甜菊双糖苷9 种甜味剂的检测方法。样品通过超纯水超声提取，在正负离子MRM 模式下分析定量。在甜蜜素（环已基氨基磺酸钠）、阿力甜、糖精钠、纽甜、安赛蜜、阿斯巴甜标准溶液质量浓度为10.0～200.0 ng/mL，三氯蔗糖、甜菊糖苷、甜菊双糖苷标准溶液质量浓度为20.0～2 000.0 ng/mL 范围内线性良好，相关系数均大于0.999，在饮料、八宝粥和面包不同阴性样品基质中0.50，1.00，3.00 mg/kg和1.00，2.00，6.00 mg/kg 质量浓度水平下9 种甜味剂的平均加标回收率为81.4%～105.3%，RSD 为1.2%～4.1%。经方法学验证，该方法具备前处理易操作、检测周期短、重现性好、灵敏度高、成本低等优点，最终结果可靠，适用于食品中9 种甜味剂的快速筛查和定量测定，并可应用于实际工作中。