盆底器官脱垂动物模型构建研究进展*

袁佳坤,陈国庆,王 琼,于 霞 综述,陈 颖△ 审校

1.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院/成都市妇女儿童中心医院妇产科,四川成都 610091;2.电子科技大学医学院,四川成都 610091;3.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院/成都市妇女儿童中心医院检验科,四川成都 610091

盆底器官脱垂(POP)被定义为盆底肌肉和筋膜无力造成的盆腔器官一个或多个部分从正常解剖位置下降到阴道或突出于阴道外的一组疾病[1-2],严重影响患者的生活质量。POP的患病率为8%～41%,其中症状性POP发病率约为9.6%。POP和尿失禁修复的长期成功率仍然很低,高达30%的患者需要进行矫正手术[3]。POP与肌无力导致的内脏下垂均与结缔组织功能障碍有关[4],但其下垂器官、致病原因及发病机制等存在差异。其中,肌无力导致的内脏下垂是通过韧带及筋膜固定于腹壁,其致病原因包括全身的肌无力、消瘦、膈肌力量减弱、腹部脂肪减少、腹腔收缩力减弱以及女性多次妊娠等导致的腹壁肌肉无力及韧带松弛,从而使内脏器官的张力减退导致内脏下垂。但POP为阴道前壁、阴道后壁和(或)阴道顶点(子宫切除术后的宫颈或穹窿)的下降,年龄和分娩是最重要的致病因素[5],其通过损伤盆底支撑结缔组织使骶主韧带复合体生物力学性能受损。目前已知与POP相关的高危因素主要包括妊娠、阴道分娩、肥胖、衰老、遗传易感性、激素水平、更年期,以及既往子宫切除术和便秘[5]等。针对POP发病的各种高危因素,研究者们构建了相关动物模型进行研究。本文通过查找和分析近期国内外POP动物模型的相关文献,以期为研究者们构建POP动物模型提供新思路。

1 实验动物的选择

主要为啮齿类动物、兔、绵羊、灵长类动物。

1.1啮齿类动物 啮齿类动物包括大鼠和小鼠,二者都可以在相对较短时间对经阴道分娩方式导致POP的病因进行评估,比较如下。

1.1.1小鼠 费用低,繁殖能力强,发情周期较短,对于满足POP的致病原因具有先天的优势。现用于POP研究的两种最常用的小鼠是Fbln5 KO和Loxl1 KO[6]。此外,小鼠可用于转基因敲除研究,基因敲除后其表型与人类在临床上相似,在蛋白表达和基因扩增方面得到广泛应用。

小鼠的缺点在于其体型小,在实行外科手术或注射药物以模拟盆底肌肉及筋膜损伤时操作难度较大,且影响实验结果的客观性。

1.1.2大鼠 大鼠和人类在盆底解剖学的肌肉部分及盆底支撑的结缔组织部分具有较高相似度。ALPERIN等[7]通过用微机械解剖方法测量人盆底肌的结构继而使用结构差异指数与大鼠进行比较,结果为大鼠与人类最相似。IWANAGA等[8]对盆腔韧带的组织成分进行了定量分析,结论是大鼠与人类的解剖和组织结构是相似的,并含有相同的细胞成分。因此,大鼠作为盆底疾病研究中应用最广泛的实验模型,为POP造模提供了良好的基础。

缺点在于,大鼠与大型哺乳动物及灵长类动物相比而言,其体型较小,日常活动的差异和胎儿的尺寸使得盆底器官的自然脱垂不太可能发生,这给动物模型的构建增加了难度,需要耗费更多的成本[9]。

1.2兔 有文献报道,兔具有与人类相似的细胞和组织生理学[10]。新西兰兔是常见的实验动物模型,优点是模型更大。但由于兔阴道的解剖结构与人类有很大的不同,在顺产过程中不会发生明显的盆底损伤,也不会发生自发性脱垂。与小鼠和大鼠相比,兔被广泛应用在移植物研究[11],原因是兔动物模型阴道范围广、腔隙大,利于生物移植物的存放。PER等[12]利用兔研究盆底重建手术中生物材料植入,证明了兔是评估骨盆重建手术和阴道手术的良好模型。KNIGHT等[13]通过腰椎固定术构建POP网片植入的新模型,与非人灵长类动物相比,兔阴道收缩性更强,但该模型缺乏类似于POP女性的顶端和侧阴道支撑。由于其花费相对较高,且身体耐受力低,可能在动物模型构建中死亡。

1.3绵羊 母绵羊是一种成熟的人类生殖模型,其分娩时间长,胎儿比较大,常自发性发生妊娠、顺产及难产相关的POP[14]。既往研究发现母羊通常脱垂的盆腔器官是膀胱,这与人类存在相似性;其易感因素也与人类相似,包括腹内压增高、年龄增大、多胎妊娠、子宫阴道脱垂史。研究者用丘陵地带和平地的母羊做对比,证实了腹内压影响阴道脱垂的发生。绵羊与人类POP的发生有着相似的病理生理,但由于绵羊费用昂贵,难于管理,所以较少使用。

1.4非人灵长类动物 非人灵长类动物被认为是POP中与人类最类似的实验动物[15]。目前研究的非人灵长类物种包括恒河猴、松鼠猴和狒狒。事实上,恒河猴在解剖以及生殖生理学上与人类相似,主要表现在生殖周期和分娩方式、雌激素和孕激素反应性支持组织、自发发生与阴道分娩相关的POP等方面[16],非人灵长类动物也有提肛肌,它们与人类结构具有类似的功能[17]。非人灵长类动物妊娠周期较长,并且其胎儿体质量与新生儿体质量较接近,这有利于研究妊娠和分娩对盆腔器官脱垂所产生的影响。非人灵长类动物与人类相似度极高,能够更好地建立动物模型,并用于临床转化。但其缺点包括妊娠时间长,自发POP的时间长,以及维护和寄宿的成本高。此外,作为动物模型,处理非人灵长类动物需要学习专业解剖知识,限制了其在研究中的使用。

2 模型构建方法及应用

POP动物模型的构建是通过模拟人类POP的致病因素实现,其有利于发病机制的研究,但与人类仍存在差异。在四足动物中,受力支撑点集中于脊柱。而人类的盆底支撑系统对于维持盆腔器官的正常位置至关重要。动物模型与POP患者也存在相似性。例如在啮齿类动物模型中,骨盆的结缔组织解剖结构与人类相似,它也具有子宫骶韧带。因此,啮齿类动物模型的构建与人类在结缔组织的影响方面具有相似性[18]。绵羊动物模型与人类阴道的长度及直径相似,同时,它的骨盆结构依赖于三个级别的支持,类似于DELANCEY描述人类POP的三水平理论学说。因此,绵羊模型的构建与人类在研究激素水平对盆底结构及阴道组织的影响方面具有相似性[19]。非人灵长类动物与人类具有相似的结缔组织、激素水平变化规律以及解剖结构,在研究阴道分娩导致POP的发生方面与人类相似[20]。人们对疾病病理生理学和人体解剖学的理解基础很大程度上可以归因于使用各种动物模型的临床前研究,但其结果的有效性和适用性仍存在争议[21]。

2.1机械性损伤 分娩易导致机械性损伤,是造成女性POP的主要原因,有数据表明POP最大的独立危险因素是经阴道分娩[22]。

2.1.1啮齿类动物 可用于模拟阴道分娩对盆底解剖的影响。一种方法是阴道扩张法[23],它是将一个气球插入阴道,以不同的体积(2.5～5.0 mL)充气来进行阴道扩张,并持续一段时间(1～6 h),通过机械拉伸和局部组织缺氧来构建。此实验的结果衡量指标是盆底肌肉微结构的变化(纤维和肌节长度),以确定肌节过度伸长是机械损伤和由此产生的肌肉功能障碍的主要原因。充气容积为3 mL时,可模拟阴道自然分娩的效果[24]。但其不足之处在于模型和读数都没有标准化指标。另一种方法是诱导神经损伤,这在大鼠中通常通过阴部神经挤压实现[25],目前还没有发现其单独作用于阴道的研究。

2.1.2绵羊 在动物模型构建过程中,经阴道分娩时可通过外力刺激促使力量叠加,增加盆底组织损伤概率。研究已经证明,绵羊经阴道分娩时,造成盆底肌肉中的前交叉韧带和结缔组织损伤。DE LEEUW等[26]研究表明,在阴道分娩过程中使用产钳或吸引器也会导致盆底支撑组织损伤。YOUNG等[27]在母羊中建立了改良的POP-Q测量法,表明经产动物的阴道壁与女性具有相似的无力区域。母羊有望成为人类阴道脱垂的代表性临床前模型。

2.1.3其他 NMEC团队在MRI研究中发现,各种动物盆底组织中损伤最严重的部位为肛提肌,尤其是内侧部分,称为耻骨内脏肌,该处较易发生撕裂[28]。同时,DELANCEY等[29]通过构建各类动物阴道分娩模型,证实分娩过程中肛提肌存在明显的拉伸相关损伤。因此,在动物分娩时可通过牵拉加强这些部位的收缩力度,造成盆底组织的损伤。

2.2去神经支配 去神经支配主要用于模拟阴道分娩对盆底解剖结构的影响。去神经支配本身不会引起POP,但可能导致阴道分娩动物阴道脱垂的发生。

2.2.1啮齿类动物 阴道分娩和多胎妊娠会导致盆底神经和肌肉过度拉伸。在此过程中,与肌肉相比,神经承受牵引的能力较弱,因此神经遭受的损伤更大。肽神经递质的异常,特别是血管活性肠肽和神经肽,反映了盆底结构的去神经支配程度,并作为评估盆底神经损伤的关键标志物。PIERCE等[30]研究表明,在大鼠中通过神经挤压方法构建的动物模型已被广泛用于研究压力性尿失禁,但在POP动物模型构建中缺乏研究。

2.2.2非人灵长类动物 非人灵长类动物中,松鼠猴应用较为广泛。松鼠猴的模型构建方式为切除阴部神经。其中,模拟耻骨尾肌和髂尾肌萎缩也只能通过切除神经实现[31]。经阴道分娩动物模型构建重点在于关注易发生断裂的组织及支配这些组织的神经。

2.3外科手术 衰老与激素的调控紧密联系。一种方式是通过化学诱导,可注射胶原酶或者胆碱能受体,人为地模拟盆底肌腱损伤。另一种方式可利用卵巢切除术实现,卵巢切除术是实验动物模拟绝经后女性盆底组织变化的标准手术程序。其操作为首先腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,无菌条件下在上腹部正中作一2 cm切口,切除卵巢,术后给每只动物注射青霉素预防感染。幼龄大鼠在16周后阴道组织僵硬度显著增加。

有研究表明,会阴切开术会使肛门失禁的发生率增加,可能在造成POP中发挥一定作用,但尚不能明确[32]。在动物模型的构建中,可尝试使用此术式构建动物模型,如使用会阴切开术建模则需要使用限制性会阴切开术。此外,耻骨肌及肛提肌在维持盆腔组织稳定方面发挥重要作用,可通过手术离断方式建立模型。

3 评价指标

POP发病率呈逐年上升趋势,其主要原因为人口老龄化加剧,且患病率和严重程度随年龄的增加而增加。衰老可诱发氧化应激从而通过各种信号通路导致成纤维细胞线粒体功能障碍,损伤细胞骨架,最终导致骶韧带生物力学性能损伤。此外,衰老也可导致雌激素水平下降,而雌激素受体表达的变化也会影响女性患POP的风险[18,33]。POP评价指标包括肉眼可见动物模型器官的脱垂,以及生物力学性能的测定,如:生物组织的被动生物力学特性,啮齿动物阴道支持组织复合体的结构特性、机械性能、组织异性、黏弹性和黏塑性等[34]。研究证明,在兔模型中可通过评估标本的宿主炎症反应、新生血管形态、弹性蛋白含量和胶原含量评价其组织学特征,通过单轴拉伸试验对生物材料进行生物力学评估,以确定组织复合材料的刚度、极限抗拉强度和极限抗拉强度下的载荷[35]。同时,研究表明在猪模型中可通过骶骨固定术对不同生物移植材料进行生物力学性能比较[36]。可通过影像学手段进行肛提肌损伤的检查、确定盆底器官位置及观察运动度的变化、检查盆底支持结构解剖的异常等评价盆底组织有无损伤。

4 总结和展望

本文讨论了动物模型的优缺点、动物模型构建和评价指标。学者们希望通过动物模型的构建找到POP的发病机制,以期寻找最佳治疗方案。近些年动物模型虽发展迅速,但由于盆底支撑系统结构复杂,动物模型与人类盆底结构仍存在较大差异。大鼠是目前模型构建最常用的动物,阴道组织是最常用的部位,机械损伤和外科手术是常用的建模方式,但在研究过程中应根据研究目的选择合适的动物模型。POP发病机制极其复杂,涉及盆底结构、基因、营养、衰老等内因及分娩、长期慢性刺激、药物等外因;同时,其也涉及影像学、组织学、细胞、分子水平等,其具体发病机制至今尚不清楚,目前虽然有上述动物模型,但大多都只能从某一个方面进行研究。随着我国人口老龄化进程加快,未来对衰老及雌激素水平变化方面可进行深入研究。通过构建动物模型研究导致衰老的相关信号通路,寻求临床治疗靶点。相信随着医学技术的不断发展,未来能够采取积极的干预措施预防POP的发生,为POP的早期诊断和早期治疗提供帮助。