JNK通路介导的铁死亡在三阴性乳腺癌细胞增殖及凋亡中的作用

张晨欣，周 昱

(佳木斯大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江佳木斯 154002)

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受 体-2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)表达均呈阴性的乳腺癌，具有发病年龄早、组织学级别高、复发和远处转移发生率高的特点，并且TNBC 无法从内分泌治疗和抗HER-2 靶向治疗中获益，因此治疗难度大、预后差[1-2]。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是丝裂原活化蛋白激酶家族的成员，以磷酸化形式发生激活后调控细胞增殖、存活、分化，在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用[3-5]。已有研究[6]报道促进JNK 磷酸化(p-JNK)对TNBC 细胞具有抑制增殖和促进凋亡作用，但JNK发挥调控作用的分子机制尚不明确。

铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式，具体指细胞内铁过载造成脂质氧化物代谢失调、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)大量产生而引起的细胞死亡[7-9]。JNK 是铁死亡的上游调控因素，有研究报道JNK磷酸化后激活铁死亡并抑制卵巢癌细胞的增殖[10]；也有研究报道铁死亡激活后，TNBC细胞的增殖减弱、凋亡增强[11]。但JNK 在TNBC 细胞铁死亡中的调控作用及生物学意义尚未见报道。基于此，本研究将通过临床TNBC 样本检测及细胞实验分析JNK 通路介导的铁死亡在TNBC细胞增殖及凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 组织样本与细胞系

选择2020 年1 月—2022 年5 月于佳木斯大学附属第一医院肿瘤科手术切除的105 例TNBC 癌组织和癌旁正常组织，纳入标准：①经术后病理诊断为TNBC；②均留取TNBC 癌组织和距离病灶边缘5 cm以上的癌旁正常组织；③临床资料完整。排除标准：①术前接受过放化疗、内分泌治疗、靶向治疗等；②既往有其他恶性肿瘤病史。

TNBC 细胞系MDA-MB-231 以及乳腺癌(非TNBC)细胞系MCF-7、SK-BR-3购自中国科学院上海细胞资源中心。

1.2 主要试剂与仪器

二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、JNK 激动剂ANISO、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1 均购自美国MCE 公司；CCK-8 法细胞增殖检测试剂盒、TdT 介导的dUTP 原位切口末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法细胞凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天生物科技公司；谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒均购自南京建成生物研究所；总RNA 提取试剂盒、cDNA 第一链合成试剂盒、荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qPCR)检测试剂盒均购自北京天根生化科技公司；小鼠抗人JNK、p-JNK 特异性抗体购自CST 公司，小鼠抗人TFR1、GPX4特异性抗体购自Abcam公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司，倒置显微镜购自日本尼康公司，凝胶成像系统购自上海天能公司。

1.3 试验方法

1.3.1 Western blot 检测癌组织中p-JNK、TFR1 和GPX4 蛋白的表达取TNBC 组织和癌旁组织各约30 mg，使用裂解液在冰上对组织进行裂解、提取蛋白，测定蛋白浓度后将含有30 μg 蛋白的样本用于电泳。在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离蛋白，电转硝酸纤维素膜后用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，4 ℃孵育JNK 一抗(1∶500 稀释)、p-JNK 一抗(1∶500 稀释)、TFR1 一抗(1∶800稀释)、GPX4一抗(1∶1 000稀释)或β-actin 一抗(1∶3 000 稀释)过夜，次日用1∶2 000 稀释的二抗室温孵育1 h，最后在凝胶成像系统中曝光得到的条带，以β-actin 为内参，计算p-JNK、TFR1、GPX4 蛋白的相对表达水平，并对3 种蛋白表达的相关性进行分析。

1.3.2 细胞培养和分组MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3细胞分别在含有10%胎牛血清的培养基中贴壁培养，每2 d用0.25%胰蛋白酶消化传代1次。传代后的MDA-MB-231细胞进行分组给药：对照组用含有体积分数为0.1% DMSO的培养基处理，JNK激动剂组参照文献[10]用含有5 μmol/L ANISO 的培养基处理，铁死亡抑制剂组参照文献[12]用含有2 μmol/L Ferrostatin-1的培养基处理，激动剂+抑制剂组用含有5 μmol/L ANISO+2 μmol/L Ferrostatin-1 的培养基处理。每组均重复4 次，连续培养24 h。MCF-7 和SKBR-3 细胞用于和MDA-MB-231 对比，不进行JNN 激动剂或铁死亡激动剂的处理。为了比较乳腺癌MCF-7、SK-BR-3细胞(非TNBC细胞株)与TNBC 细胞株MDA-MB-231 细胞中p-JNK、TFR1、GPX4 蛋白表达的差异，收集上述3 种细胞进行裂解后按1.3.1步骤对p-JNK、TFR1和GPX4蛋白的表达进行检测。

1.3.3 MDA-MB-231 细胞增殖的检测将MDAMB-231细胞以每孔1×104个接种在96孔培养板中分组处理24 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，孵育1 h后将培养板放入酶标仪，设置波长为450 nm 检测吸光度，按照[D(450)对照组-D(450)实验组]/D(450)对照组×100%计算细胞增殖抑制率。

1.3.4 MDA-MB-231 细胞凋亡的检测将5×104个MDA-MB-231 细胞接种在48 孔培养板中处理24 h 后弃去培养基，PBS 冲洗2 遍后用4%多聚甲醛固定1 h，而后采用TUNEL试剂盒进行染色，用含DAPI的抗荧光淬灭封片液固定，在荧光显微镜下观察4 个高倍视野(400 倍)中TUNEL 阳性染色细胞和DAPI 阳性染色细胞并计数，按下式计算细胞凋亡率。

细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数/DAPI阳性细胞数×100%

1.3.5 MDA-MB-231 细胞中GSH、SOD、MDA 的检测MDA-MB-231 细胞接种在12 孔培养板中，分组给药24 h后收集细胞。使用裂解液在冰上对细胞进行裂解，得到裂解液后GSH 采用比色法进行检测、SOD采用羟胺法进行检测、MDA采用硫代巴比妥酸法进行检测，均按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.6 MDA-MB-231 细胞中TFR1 和GPX4 表达的检测将1×106个MDA-MB-231细胞接种在12孔培养板中，分组给药24 h后收集细胞。一部分细胞用试剂盒提取细胞中的总RNA，采用cDNA 第一链合成试剂盒将提取得到的总RNA反转录为cDNA，用qPCR检测试剂盒对cDNA 中的TFR1、GPX4 进行扩增检测。qPCR 的体系为：cDNA 1 μL、试剂盒中反应混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL，去离子水补足至20 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃、15 s，特异性退火(TFR1基因60 ℃、GPX4基因58 ℃)25 s，72 ℃、30 s，共进行40 个循环。反应结束后得到循环曲线及循环阈值(CT)，以β-actin 为内参、按照公式2-ΔΔCT计算TFR1、GPX4的mRNA相对表达水平。另一部分MDA-MB-231细胞使用裂解液在冰上对细胞进行裂解检测蛋白表达，后续操作过程同1.3.1。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0 软件进行统计学处理，计量资料以表示，两组间比较采用配对样本t检验，四组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNBC组织中p-JNK、TFR1和GPX4蛋白的表达

与癌旁组织比较，TNBC 组织中p-JNK、TFR1 蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)，GPX4 蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)，见图1A 和B。经Pearson 检验，TNBC组织中p-JNK蛋白与TFR1蛋白的表达水平呈正相关(r=0.515，P<0.01，图1C)，p-JNK蛋白与GPX4蛋白的表达水平具有负相关关系(r=-0.442，P<0.01，图1D)。

图1 TNBC组织中p-JNK、TFR1和GPX4蛋白的表达

2.2 TNBC 细胞株中p-JNK、TFR1 和GPX4 蛋白的表达

结果见图2，与乳腺癌MCF-7、SK-BR-3细胞(非TNBC 细胞系)比较，TNBC 细胞系MDA-MB-231 细胞中p-JNK 和TFR1 蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)，GPX4 蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。故后续试验均在MDA-MB-231细胞中进行。

2.3 JNK 激动剂及铁死亡抑制剂对TNBC 细胞增殖、凋亡及氧化应激水平的影响

结果见表1，与对照组比较，TNBC细胞的增殖抑制率和凋亡率在JNK 激动剂组均升高(P<0.05)；铁死亡抑制剂组无显著变化(P>0.05)；激动剂+抑制剂组居中，该组细胞的增殖抑制率和凋亡率低于JNK激动剂组、高于铁死亡抑制剂和对照组(均为P<0.05)。与对照组比较，JNK 激动剂组TNBC 细胞中GSH 和SOD 活性均显著降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；铁死亡抑制剂组TNBC 细胞的GSH、SOD 活性及MDA 含量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；激动剂+抑制剂组GSH和SOD活性均高于JNK激动剂组而低于铁死亡抑制剂组(P<0.05)，MDA 含量低于JNK 激动剂组而高于铁死亡抑制剂组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 JNK激动剂及铁死亡抑制剂对TNBC细胞增殖、凋亡及氧化应激水平的影响(n=4，x±s)

2.4 JNK 激动剂及铁死亡抑制剂对TNBC 细胞中TFR1和GPX4表达的影响

结果见图3和图4，与对照组比较，JNK激动剂组TNBC细胞中TRF1 mRNA和蛋白的相对表达水平均显著升高而GPX4 mRNA 和蛋白的相对表达水平均显著降低(均为P<0.05)；铁死亡抑制剂组细胞中TFR1 和GPX4 的mRNA 及蛋白相对表达水平与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；激动剂+抑制剂组细胞中的TRF1 mRNA 和蛋白相对表达水平均低于JNK 激动剂组而高于铁死亡抑制剂组，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)，GPX4的mRNA和蛋白相对表达水平均高于JNK激动剂组而低于铁死亡抑制剂组，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。

图3 JNK 激动剂及铁死亡抑制剂对TNBC 细胞中TFR1 和GPX4 mRNA表达水平的影响

图4 JNK激动剂及铁死亡抑制剂对TNBC细胞中TFR1和GPX4蛋白表达水平的影响

3 讨论

TNBC 具有侵袭性强、容易发生转移和复发的特点，而且缺乏特异性治疗靶点，治疗效果欠佳，预后较差[13-15]。目前，TNBC分子机制不明确是制约其临床诊疗的主要因素。因此，研究TNBC 发病的分子机制，发现新治疗靶点具有迫切的临床需求。

丝裂原活化蛋白激酶家族中的JNK 在细胞调控中起重要作用，磷酸化为p-JNK 后对细胞生长、分化、死亡均发挥调控作用。目前关于JNK通路在恶性肿瘤中的研究认为p-JNK起到抑癌作用，在多种恶性肿瘤组织中JNK 磷酸化不足、p-JNK 表达缺失，促进JNK磷酸化对癌细胞的生长和转移均具有抑制作用[16-19]。本研究对TNBC 组织与癌旁组织中JNK 磷酸化水平的分析显示，与对应的癌旁组织比较，TNBC 组织中p-JNK 的表达水平降低，提示JNK 磷酸化不足与TNBC 的发病有关；进一步在TNBC 细胞系MDAMB-231 中进行实验，JNK 激动剂ANISO 处理后细胞的增殖抑制率及凋亡率均明显增加，表明激活TNBC细胞系中JNK起到抑制增殖、促进凋亡的作用，进而提示JNK通路在TNBC的发病中起抑癌作用。

JNK 通路在细胞中参与内质网应激、细胞自噬、细胞铁死亡等生物学环节的调控[20-23]。近些年乳腺癌相关的基础研究认为铁死亡异常可能是TNBC 发病的重要环节，诱导TNBC 癌细胞发生铁死亡可以有效抑制乳腺癌的进程[6，24-25]。TFR1和GPX4是铁死亡标志基因，既往研究发现TFR1 介导了三价铁进入细胞并促进脂质过氧化物生成、导致铁死亡的发生[26-27]，GPX4能够将有毒性的脂质过氧化物还原为无毒性的脂醇并抑制铁死亡[28-30]。本研究对以上两种铁死亡标志基因的检测结果显示，TNBC 中TFR1 的表达降低且与p-JNK 呈正相关、GPX4 的表达增加且p-JNK 呈负相关，提示TNBC 病灶中铁死亡受到抑制且可能受到上游JNK 通路的调控。本文进一步通过细胞实验证实，JNK 激动剂ANISO 处理TNBC 细胞后TFR1 的表达增加、GPX4 的表达降低。这一结果表明激活JNK 使TNBC细胞的铁死亡加剧，进而提示TNBC中JNK通路对铁死亡具有促进作用。

为了深入认识JNK 调控铁死亡在TNBC 细胞增殖和凋亡中的作用，本研究在JNK 激动剂处理TNBC 细胞的同时联合使用了铁死亡抑制剂，结果表明JNK激动剂+铁死亡抑制剂联用较单用JNK 激动剂抑制增殖、促进凋亡的作用明显减弱，表明JNK 通路对TNBC 细胞增殖和凋亡的调控作用部分依赖于激活细胞铁死亡。铁死亡的另一特征是ROS大量生成所导致的MDA 含量增多、GSH 和SOD 活性降低，本研究实验结果发现JNK激动剂后出现了相应的MDA、GSH和SOD 变化，联合使用铁死亡抑制剂则明显削弱JNK 激动剂对MDA、GSH和SOD的影响，由此进一步验证了JNK通路对TNBC铁死亡的调控作用。

综上所述，JNK 通路通过激活铁死亡的方式抑制TNBC 细胞增殖，促进细胞凋亡，JNK 通路调控铁死亡可能成为研究TNBC发病机制及治疗手段的新靶点。