氧化应激致自噬在光气诱导的急性肺损伤中的作用

郭晓洁，刘鹏晖，龙 子，李佳威，涂永梅，李文丽，*，刘启玲*

(1.陕西中医药大学公共卫生学院，陕西 咸阳 712046；2.空军军医大学军事预防医学系军事毒理学与防化医学教研室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，陕西 西安 710032)

光气是一种剧毒气体，问世已有200 余年，在第一次世界大战期间曾被作为化学武器使用[1-2]。虽然光气的毒性非常强，但它在工业生产过程中发挥着重要作用。目前，光气被广泛应用于工业生产中，如农药、塑料、染料、聚氨酯的合成以及冶金行业，并且在制药生产过程中同样是一种不可或缺的中间体[3]。近年来，在工业生产中因操作不当导致光气泄漏事故频发，最终造成职业人员的伤亡。例如在2021年河南宇锐化工科技有限公司三车间发生光气和氯化氢混合气体泄漏，造成2人死亡、13人住院治疗，直接经济损失300.93万元。然而，现有研究对于光气暴露的毒性机制仍不清楚，并且缺乏特效救治手段[4-5]。因此，研究光气的毒性机制并确定有效的治疗策略是目前亟须解决的重大科学问题。

光气暴露主要损害呼吸系统。光气引起的急性肺损伤(acute lung injury，ALI)通常与短时间内吸入大量光气有关[6-7]。而长期、低剂量接触可引起慢性通气不足、难治性肺水肿及其他相关肺部损伤，最终导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的发生[8-9]。在呼吸道接触光气后，初期主要症状为轻度干咳，早期还会伴有黏膜刺激症状[10]。如果暴露者仍长时间处于致病环境中，呼吸道刺激症状会在几小时内迅速发展，通常表现为剧烈咳嗽、胸闷以及喘息[7]。在大量或长时间吸入光气后，会出现典型ALI 的临床症状，包括肺水肿、呼吸困难和低氧血症，严重时可能发展为ARDS[11]。在ALI的晚期，患者往往会出现慢性肺部疾病，包括气流受阻、纤维化[12]、气道高反应性以及气体交换障碍等[13-14]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一类性质非常活泼的分子，在机体内过量蓄积时会通过攻击关键的生物大分子，最终导致组织细胞的损伤。在生理条件下，通过保持氧化还原稳态的平衡，肺组织中的ROS 含量始终保持在一个较低的水平[15]。已有研究表明，过量ROS 会引起肺内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤[16]，同时伴有肺毛细血管通透性的增加和肺泡表面活性物质的减少，导致肺水肿和肺不张，最终发展为ALI[17]。研究表明，这些受损细胞会激活自噬以维持细胞内稳态[18-19]，但过度自噬也会导致细胞死亡。既往研究显示，ROS介导的大分子和细胞器氧化或轻度氧化应激激活自噬通路，清除受损的大分子和蛋白聚集物，维持机体内环境稳定。自噬是受ROS和氧化应激调节的最重要的生物反应之一[20]。

由于氧化还原平衡稳态的破坏在光气暴露诱导的ALI 中具有重要的调控作用，因此提示我们，过量ROS在肺组织中蓄积可能是光气发挥其毒作用的关键环节之一。但目前光气暴露是否能够诱导肺组织ROS水平上升，以及ROS 水平上升后诱导ALI 发生的机制仍不清楚。本研究旨在阐明大鼠光气暴露模型中肺组织ROS水平的变化，并将自噬作为研究的新方向，初步明确氧化应激是否调控自噬缓解光气诱导的ALI，为光气肺损伤的救治提供潜在干预靶点和策略。

1 材料与方法

1.1 动物及其饲养

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，8 周龄，体质量180～220 g，购自空军军医大学实验动物中心。将所有大鼠圈养在环境温度为(24±2)℃，相对湿度为(55±5)%的动物笼里，自由摄入水和饲料，12 h/12 h明暗交替。每日定时观察动物一般状况，经过4～5 d 的适应性喂养后进行后续实验。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂光气(气瓶规格：体积10 L、气压150 bar)购于德国林德公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)试剂盒购于TIANGEN 公司；雷帕霉素(rapamycin，RPM)、乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)购于中国MCE 公 司(AY-22989，HY-B0215)；NF-E2 相关因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase1，HO-1)、SOD 和CAT抗体购于美国Affinity 公司；LC3II/LC3I、Beclin-1 和P62 抗体购于美国Abcam 公司；β-actin 抗体购于Bioworld公司。

1.2.2 主要仪器光气鼻吸入染毒设备，购于德国拜耳公司；全身体积描记检测系统，购于Whole Body Plethsmography 公 司；Nikon ECLIPSE Ni-U 正置荧 光显微镜、FLUOstar Omega多功能酶标仪、蛋白电泳系统、半干转装置及凝胶成像与分析系统、T100 梯度PCR 仪、实时定量PCR 仪，均购于美国Bio-Rad 公司；超微量分光光度计，购于美国Denovix公司。

1.3 方 法

1.3.1 动物分组和处理为探讨光气暴露动物模型最适浓度，通过随机数字表法将50 只SD 大鼠随机分为对照组、染毒后6、12、24和48 h组，每组10只。自适应喂养1 周后，对照组大鼠鼻吸入空气，光气染毒组大鼠鼻吸入41 mg/m3的光气，动态染毒30 min。染毒结束后，分别在6、12、24和48 h时测定大鼠肺功能，随后使用戊巴比妥钠(50 g/L)麻醉并处死大鼠，取大鼠肺组织和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)进行相关指标的检测，后选择染毒后12 h组作为本研究动物模型(后称光气组)。为探讨自噬在光气诱导的急性肺损伤中的作用，将40只大鼠随机分为对照组、光气组、RPM处理组和RPM对照组，每组10 只。RPM 处理组和RPM 对照组在光气暴露和空气

暴露后立即给予自噬激动剂RPM(5 mg/kg)，腹腔注射处理，对照组和光气组注射相同体积的生理盐水。为探讨氧化应激对自噬的调控作用，另取40只大鼠分为对照组、光气组、NAC处理组和NAC对照组，每组10只。NAC处理组和NAC对照组在光气暴露和空气暴露后立即给予抗氧化剂NAC(200 mg/kg)，腹腔注射处理。对照组和光气组处理如前所述。光气暴露后12 h麻醉大鼠收集肺组织和BALF。

1.3.2 肺湿质量与肺系数检测肺湿质量与肺系数是肺水肿的重要指标。取下肺组织，擦干表面血液，立即称取质量。肺系数为每只大鼠的肺湿质量与体质量的比值。

1.3.3 肺泡灌洗液总蛋白浓度测定大鼠处死后，取出完整的双肺进行心肺分离，将大鼠右主支气管结扎，使用5 mL注射器经灌胃针将3 mL生理盐水缓慢注入左肺，停留30 s 后吸出收集于EP 管内。重复以上步骤一次，将两次收集的BALF 在4 ℃条件下，1 000 r/min 离心5 min，吸取上清使用BCA 法测定总蛋白浓度。

1.3.4 组织病理学检测选择未行BALF 收集的大鼠右肺组织，使用预冷的PBS 洗涤，再用4% PMO 固定，连续梯度浓度的乙醇脱水，石蜡包埋，切成5 μm 切片，苏木精、伊红染色。使用光学显微镜进行组织病理学观察。

1.3.5 全身体积描记系统检测大鼠肺功能光气染毒后6、12、24 和48 h，将大鼠放入全身体积描记检测仓，大鼠适应5 min 后，进入15 min 的正式监测程序，获取大鼠支气管收缩系数，呼气末暂停和呼吸暂停指标。

1.3.6 DHE 染色检测ROS 含量取新鲜的肺组织放置在自制凹槽内，立即加入适量的OCT包埋剂浸没组织，液氮速冻10～20 s 后置入恒冷箱切片机冰冻切片，厚度为5 μm，组织固定液固定30 min 后蒸馏水洗净待用。将50 μL浓度为10 mol/L的DHE溶液滴入切片中，在37 ℃下孵化30 min。PBS清洗3遍后滴加封闭液，使用荧光显微镜观察图像，最后使用ImageJ软件进行量化分析。

1.3.7 组织免疫荧光染色法检测肺组织4HNE 的表达将肺组织切片脱蜡后经过高温抗原修复，用含0.3% Triton X-100 透膜后，血清封闭。切片与兔抗4HNE 在4 ℃孵育过夜。PBS 洗涤后，滴加二抗，室温下避光孵育30 min，DAPI 复染细胞核10 min，观察细胞核。PBS 充分洗涤后封片，于荧光显微镜下观察并拍照，使用ImageJ软件进行量化分析。

1.3.8 肺匀浆抗氧化酶活性检测称取所需质量的肺组织，按质量(g)∶体积(mL)=1∶9 的比例，加入生理盐水制成组织匀浆。采用SOD、CAT和GSH检测试剂盒分别测定肺匀浆中SOD、CAT 的活力和GSH 含量，严格按照试剂盒内说明书操作。

1.3.9 Western blot检测氧化还原及自噬相关蛋白表达水平用组织研磨机将标本放入组织溶解缓冲液中匀浆，制备肺组织蛋白提取物。裂解液经离心取上清，用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。根据所需的分子质量分离范围，在10%或12%的SDS-PAGE 凝胶中，加入30 μg 蛋白样品，电泳结束后，并将其均匀地分布在PVDF 膜表面，以便进一步的分析。使用以下一抗Nrf2、HO-1、SOD、CAT(均按1∶1 000 稀释)，Beclin-1(1∶2 000稀释)，P62(1∶10 000稀释)和LC3II/LC3I(1∶2 000稀释)在4 ℃条件下封闭过夜。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶结合抗体室温下孵育1 h。再次洗膜后使用凝胶成像系统对蛋白可视化，以β-actin作为内参，采用ImageJ软件进行量化。

1.3.10 RNA 提取和定量PCR按照说明书使用TRIzol法提取每只大鼠的肺组织总RNA。根据260 nm波长下的吸光度值计算RNA含量，通过A260/A280比值来确定RNA 纯度。用逆转录酶逆转录总RNA。以β-actin为内源性对照，进行qPCR反应，qPCR引物见表1。循环条件为95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s。采用2-ΔΔCT法计算Nrf2、HO-1、SOD 和CAT的mRNA相对表达水平。

表1 qPCR引物序列信息

1.4 统计学方法

数据以均数±标准差表示，应用GraphPad Prim 9.0 软件进行分析，组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 光气暴露对大鼠肺组织的损伤效应

为了明确光气暴露对大鼠肺组织的损伤效应，我们使用41 mg/m3光气经呼吸道动态暴露30 min后，在各个时间点对大鼠各项指标进行检测，结果见图1。HE 染色结果显示，光气暴露后不同时间点均产生了一定损伤效应。与对照组相比，暴露后6 h，肺泡内有明显炎性渗出，肺泡壁部分断裂，但基本能够维持肺泡正常结构。暴露后12 h，肺泡融合，肺间质增厚，炎性细胞增多。而暴露后24和48 h，肺组织的病理结构有所恢复，炎性渗出有所减轻。肺湿质量及肺系数结果显示，与对照组相比，各个时间点均有变化，但暴露后12 h 组变化最为显著。此外，大鼠BALF 总蛋白浓度、支气管收缩系数、呼气末暂停以及呼吸暂停等指标均表现出了相似的结果。由此可见，使用41 mg/m3光气经呼吸道暴露30 min能够诱导大鼠发生ALI，并且在暴露后12 h 时损伤效应最为显著。

图1 光气染毒后不同时间对大鼠肺组织的损伤效应

2.2 光气暴露对大鼠肺组织氧化还原平衡的影响

在光气暴露的大鼠肺组织中，我们观察到了活性氧水平的变化。如图2 所示，与对照组相比，在光气暴露的大鼠肺组织中，不同时间点DHE染色的荧光强度均升高，其中暴露后12 h 组荧光强度变化最为显著。4HNE 染色结果表现出了与DHE 染色结果相同的变化趋势，表明肺组织的脂质过氧化水平升高。检测一系列抗氧化酶的表达水平及酶活力，如图3 所示，发现光气暴露后，Nrf2 和HO-1 的转录水平升高，SOD和CAT的转录水平降低。抗氧化酶的蛋白表达水平趋势与转录水平趋势基本一致。SOD及CAT的酶活力结果显示，光气暴露后，与对照组相比，抗氧化酶活性降低，其中暴露后12 h 组的变化最为明显。同时，光气暴露组的肺组织GSH含量显著降低。以上表明，光气暴露后肺组织氧化还原平衡发生紊乱。

图2 光气染毒后不同时间大鼠ROS和脂质过氧化水平变化

图3 光气染毒后不同时间大鼠抗氧化酶表达水平和活性变化(n=3)

2.3 光气诱导的ALI与自噬的关系

除ROS 的变化外，在光气暴露的大鼠肺组织中，我们还观察到了自噬的变化，结果见图4。与对照组相比，光气暴露后大鼠肺组织中Beclin-1 和LC3II/LC3I蛋白的表达水平降低(P<0.05)，而P62蛋白的表达水平升高，说明自噬程度明显降低。使用自噬激动剂RPM 处理后，上述分子的表达水平明显恢复，说明RPM缓解了光气抑制的自噬(图4A～D)。我们观察RPM处理后肺组织ALI情况，HE染色显示，肺组织的病理结构有所恢复，炎性渗出有所减轻(图4E)。并且使用RPM提高自噬水平后，肺湿质量及肺系数有所恢复(图4F～G)。大鼠BALF总蛋白浓度、支气管收缩系数、呼气末暂停时间以及呼吸暂停等指标均表现出了相似的结果(图4H～K)。以上结果表明，自噬激动剂RPM能够缓解光气诱导的ALI。

图4 RPM处理的光气暴露大鼠自噬水平变化及ALI程度

2.4 ROS对自噬的调控在光气诱导ALI中的作用

结果见图5，使用抗氧化剂NAC 处理光气暴露的大鼠，DHE 的荧光强度明显下降(P<0.01)，说明NAC缓解了光气诱导的ROS 升高(P<0.01)。由于我们已经证实了ROS 和自噬在光气暴露诱导的ALI 中发挥重要作用，为了探讨二者之间的调控方式，我们检测NAC处理后自噬相关蛋白的表达情况。结果表明，Beclin-1 和P62 在经抗氧化剂处理后蛋白表达水平均有所恢复，说明ROS与自噬存在相关关系，并且在光气暴露诱导的ALI 中，自噬程度的变化能够由ROS 水平调控。进一步研究NAC 处理后肺组织ALI 情况，HE 染色显示，肺组织的病理结构有所恢复，炎性渗出有所减轻(图6A)。并且使用NAC清除活性氧后，肺湿质量及肺系数结果有所恢复(图6B、C)。大鼠BALF总蛋白浓度、支气管收缩系数、呼气末暂停以及呼吸暂停等指标均表现出了相似的结果(图6D～G)。综上所述，使用NAC处理后促进自噬水平的恢复，从而缓解了光气诱导的ALI。

图5 NAC处理的光气暴露大鼠ROS及自噬水平变化

图6 NAC处理的光气暴露大鼠ALI程度

3 讨论

ALI 发生发展过程中一个重要的病理生理变化就是肺水肿，并且其产生原因包含多方面因素[21]。一方面，吸入光气后会迅速与肺泡表面活性物质发生作用[22]。在表面活性物质耗尽后，剩余的光气开始与肺组织中的蛋白质、脂质以及核酸发生反应，导致质膜受损，进而破坏肺血气屏障，最终导致肺水肿[23]。同时，这一过程伴随着大量的炎性介质和ROS 的释放，导致肺泡毛细血管通透性的增加，加重了肺水肿的症状[24-25]。现有的研究大部分集中在案例研究或人群的回顾性研究，使用动物模型深入研究其作用机制的数量相对较少，并且并未得出一致性的结论。本研究中，我们发现光气染毒后不同时间点，大鼠肺组织肺泡完整性受损，可见明显出血、炎症细胞浸润和水肿。肺湿质量，肺系数及BALF 明显增加，肺功能下降，以暴露后12 h最显著。以上指标表明我们成功建立了光气暴露诱导SD大鼠ALI的动物模型，并且观察到ALI 的时间-效应关系，为后续的机制研究打下了基础。

此外，我们还在光气暴露动物模型的肺组织中观察到活性氧水平的明显升高、抗氧化酶活性的明显降低以及抗氧化酶表达水平的明显变化，并且与ALI 的时间-效应关系变化趋势基本一致。结果表明，光气暴露能够诱导肺组织中大量ROS的产生以及抗氧化酶系统的激活。与一些研究相似，光气诱导ALI 的过程通常伴随着CAT、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和SOD 等抗氧化酶的异常表达[26]。Nrf2是一个在细胞中普遍存在的转录因子，当机体处于氧化-抗氧化状态失衡时，细胞核外的Nrf2 被激活，同时调控下游的抗氧化酶HO-1 表达增高，以维持细胞内的氧化还原平衡[27]。研究表明，抑制Nrf2 会导致Nrf2 介导的抗氧化酶系统紊乱，引起氧化应激，进一步加重肺部损伤[28]。在本实验中，qPCR 和Western blot 显示，光气组大鼠Nrf2 和HO-1 水平升高，而SOD和CAT的水平降低，我们猜测这种结果可能与不同抗氧化酶对光气的敏感性不同有关。同时我们的研究发现，给予抗氧化剂NAC可以改善光气暴露导致的氧化损伤以及肺水肿的症状，表明氧化损伤在光气诱导的肺水肿中发挥关键作用。我们证明了氧化还原平衡紊乱可能是导致光气诱导的ALI 早期阶段一个不可或缺的环节。

大量研究表明，ROS 是营养缺乏导致自噬的早期诱导因素[29]。Zhang等[30]的一项研究提出，是参与葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸或血清剥夺后诱导的自噬的主要ROS。而其他研究结果表明，H2O2是饥饿状态下首先产生的分子。本研究发现，光气暴露后大鼠肺组织中自噬水平降低，使用NAC 处理后其程度有所恢复，与使用自噬激动剂RPM处理后结果相似，对光气诱导的ALI 有明显的缓解作用。因此，本研究证实，ROS能够调控自噬程度，并且通过抑制自噬，在光气诱导的肺水肿中发挥损伤作用。同时，我们还提出抗氧化剂治疗可能是预防或改善ALI 的潜在治疗策略，而在已经产生ALI 时可以使用雷帕霉素等能够激活自噬过程的药物进行处理，以缓解光气诱导的ALI。