基于分子对接和表面等离子体共振技术筛选肉苁蓉复方制剂中AChE抑制剂的研究

龚福恺，刘佳丽，张石蕾*

(1.新疆维吾尔自治区人民医院药学部，新疆乌鲁木齐 830001；2.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830017；3.新疆医科大学公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐 830017)

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)作为生物神经传导中的关键酶，能催化神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)水解为胆碱和乙酸，从而终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，阻断神经信号的传递[1]。所以AChE 活性升高会导致乙酰胆碱水平降低，而乙酰胆碱减少是许多神经系统疾病如重症肌无力、青光眼及阿尔茨海默病的关键病因，因此抑制乙酰胆碱酯酶活性提高乙酰胆碱水平是治疗重症肌无力、青光眼及阿尔茨海默病的重要方法[2-6]。目前美国食品和药品监督管理局(Food And Drug Administration，FDA)批准用于治疗阿尔茨海默病的AChE 抑制剂主要有他克林、多奈哌齐、利凡斯的明、加兰他敏[7]。除加兰他敏外，大多数为合成药物，虽然有一定的治疗效果，但具有头晕、失眠、恶心、轻度腹泻等不同程度的副作用，不适于患者长期使用。因此，寻求高效低毒、适宜患者长期使用的天然来源AChE 抑制剂对治疗神经系统疾病具有重要的意义。

本课题组基于前期肉苁蓉对阿尔茨海默病、癌因性疲劳及肝纤维化的治疗作用，研制出防治神经系统疾病的中药复方——肉苁蓉复方制剂，由肉苁蓉、人参、黄芪3 种药物组成。众所周知，因为中药复方成分复杂，多靶标，系统庞大，所以从混合物体系开展研究其对机体的作用难度极大。而利用数据挖掘技术从大数据中找到我们需要的化合物组成成分，靶标等有效信息是非常实用的。其中，分子对接技术是一种基于结构的药物设计数据挖掘方法，是基于钥匙理论，通过研究配体与受体(生物大分子)之间的相互作用，预测二者结合模式和亲和力进而从分子层面解释配体作用机制的方法。表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)是一种免标记型光学生物传感方法，在研究生物分子相互作用方面具有独特优势，其具有微量化、高灵敏、通用性好及实时快速等优点，还可同时获得相互作用过程的动力学和热力学信息，便于在模拟生理条件下探究分子相互作用的整个过程[8]。

综上，本研究拟利用分子对接技术进行AChE 天然产物小分子抑制剂的虚拟筛选，从肉苁蓉、人参、黄芪3 种药物中获得最佳候选小分子。之后，通过SPR 技术验证活性成分及AChE 亲和力，以期为后续体内外机制探究，指明方向，还有望提高研发效率，为天然产物小分子抑制剂的研究开发提供启示。

1 材料与方法

1.1 试 剂

槲皮素、山奈酚均购于北京索莱宝科技有限公司；染料木素购于上海源叶生物科技有限公司；鼠源乙酰胆碱酯酶蛋白购于北京义翘神州科技股份有限公司。

1.2 仪 器

OpenSPRTM 生物分子相互作用分析系统和Sensor Chip COOH芯片，均购自于Nicoya公司。

1.3 肉苁蓉复方制剂数据库的建立

中药系统药理数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP)是基于中药材系统药理学的框架而构建的中国传统医学系统药理学数据库和分析平台(https://tcmspw.com/index.php)。我们从TCMSP数据库下载肉苁蓉、人参以及黄芪这3 种中药所含化合物的化学结构，并用ISIS 软件去除重复、合并化合物，最后分别建立肉苁蓉、人参以及黄芪这3种中药的数据库。

1.4 化合物与AChE蛋白的半柔性虚拟分子对接

1.4.1 Glide 分子对接试验对于Glide 对接，利用Maestro suite 里的蛋白质制备向导(protein preparation wizard，PPW)工具进行蛋白的准备。先用Maestro suite 直接下载质子化晶体蛋白结构(https://www.rcsb.org/)，在OPLS2005力场中进行能量最小化，填补loop和侧链，删除不需要的链、水分子及小分子，并对随机加的H进行基于氢键的重新分布，删除形成氢键少于3的水分子。在PPW准备好蛋白后，打开受体格点生产面板，根据晶体结构里面的小分子配体自动产生对接的结合位点。在格点文件产生后进行对接，并在配体对接的面板中，选择精度最高的XP 对接模式。最终保留10个对接打分的结果。

1.4.2 能量评分我们利用专业化学对接软件Rosetta，将蛋白质与多肽分子，进行柔性对接，得到初步的对接位相结构。在对接中，对每一个体系都将产生至少100 个对接结果。最后，从100 个对接位相中，挑选对接能量最好的对接结果进行结构提取，用于后续的SPR亲和力检测。

1.5 SPR技术测定活性成分与AChE蛋白的亲和力

1.5.1 蛋白芯片固定通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将蛋白偶联活化固定在COOH 芯片上，然后根据蛋白的等电点筛选蛋白质固定在COOH 芯片的最佳pH 值(4.0、4.5、5.0、5.5)和浓度(20、50、100 μg/mL)，以确保较多的蛋白固定于蛋白芯片上，其蛋白质的偶联包括3 步：EDC/NHS 的活化；蛋白质的偶联；乙醇胺封闭蛋白质多余的结合位点。

1.5.2 化合物检测液配制根据肉苁蓉、人参和黄芪3 种化合物的能量评分结果，精密称取槲皮素、山奈酚和染料木素对照品，分别以二甲基亚砜(DMSO)溶液溶解制成对照品贮备液。取各对照品储备液，加入PBS 溶液稀释100 倍，再用含1% DMSO 的PBS 溶液(pH=7.4)稀释成浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L 的对照品溶液。配体蛋白用HEPES 缓冲液稀释。

1.5.3 亲和力检测设定结合目标蛋白的流通池为检测通道，未结合目标蛋白的流通池为参比通道，开始以最大流速(150 μL/min)运行，检测缓冲液为HEPES。达到信号基线稳定后，对样本环运用缓冲液冲洗，进行排空。在信号达到基线后，调整缓冲液流速到20 μL/min。上样 EDC/NHS(1∶1)溶液激活芯片。上样激活缓冲液稀释的200 μL 的配体运行4 min，结合稳定之后，缓冲液冲洗样本环。上样200 μL封闭溶液，缓冲液冲洗样本环，并用空气排空。为确保稳定，观察基线5 min。分析物用缓冲液稀释，以 20 μL/min 上样，上样的浓度为3.125、6.25、12.5、25 和50 μmol/L，蛋白与配体结合时间均为240 s，自然解离时间为360 s。

1.5.4 亲和曲线拟合进样完成后，进行数据处理，亲和曲线拟合用TraceDrawer (Ridgeview Instruments AB，Sweden)软件进行评估，将稳态亲和力模型(1∶1)用于曲线拟合。绘制靶点蛋白与单体化合物的结合曲线，即SPR光谱图，并且计算获得动力学参数如结合速率常数ka[1/(M*s)]、解离速率常数kd(1/s)及解离平衡常数KD(M)，也叫亲和力常数。

2 结果

2.1 Glide分子对接结果

使用Rosetta 软件分别获得75、330 及87 个肉苁蓉、人参和黄芪活性分子，与AChE 相互作用的结合能量，以及对接得分见表1。结合最为稳定的肉苁蓉活性物质为槲皮素、染料木素、8-表马钱子苷酸；人参活性物质为N-亚水杨基水杨胺、山奈酚、叶酸；黄芪活性物质为槲皮素、异鼠李素、山奈酚。这表明槲皮素、染料木素及山奈酚可能为AChE 蛋白的配体物质，依据对接得分绝对值排名前3 位筛选出这3 个化合物作为对接最佳活性分子进行下一步研究。AChE蛋白结构与其小分子结合空腔见图1。

表1 肉苁蓉、人参和黄芪活性成分的Glide对接能量和评分

图1 AChE蛋白结构与AChE蛋白小分子结合空腔

2.2 对接能量排名靠前的分子体系结合模式

用PoseView 分析槲皮素与AChE 蛋白的对接结果，其对接得分为-9.397 kcal/mol，Glide 对接能量为-63.914 kcal/mol，槲皮素与AChE 蛋白作用的结合模式见图2，氨基酸残基为TYR449、ASP74、SER125、TRP86、TYR72；山奈酚与AChE 蛋白作用的结合模式见图3，结果发现山奈酚与AChE蛋白作用的氨基酸残基为SER125、TYR72、TYR337、TRP86、HIS447，其总的对接得分为-9.006，Glide 对接能量为-58.255。同上，染料木素与AChE 蛋白作用的结合模式见图4，氨基酸残基为ASP74、TYR124、TRP86、GLH202，其对接得分为-8.066，Glide对接能量为-34.421。

图2 肉苁蓉成分排名前5位的分子体系结合模式

2.3 SPR亲和力检测

采用SPR生物传感器检测活性成分槲皮素、山奈酚、染料木素与AChE 蛋白之间的亲和力，结果显示，山奈酚的解离常数Kd 值较小，各亲和力参数如表2所示，3个化合物与AChE蛋白反应作出的拟合曲线中，槲皮素、山奈酚、染料木素与AChE 蛋白亲和力均较好，如图5～7所示。

图5 乙酰胆碱酯酶和槲皮素的浓度梯度结合曲线

图6 乙酰胆碱酯酶和山奈酚的浓度梯度结合曲线

图7 乙酰胆碱酯酶和染料木素的浓度梯度结合曲线

3 讨论

天然产物是指人和动物体内许多内源性的化学成分、动植物提取物或昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物，是天然酶抑制剂的重要来源之一，吗啡、阿司匹林、喜树碱、紫杉醇和青蒿素等批准药物均是直接来源于植物或衍生于植物药。ACh是一种人体内常见的神经递质，主要作用是传递神经之间的电信号，在人脑内也具有相似的作用。人脑神经之间正常量的ACh 可以维持正常的脑活动，而AChE 就是处理前者的物质，使其维持在正常的范围内[9]。但是在阿尔茨海默病患者的脑内，可观测到AChE 的含量明显增加，导致ACh 的含量减少，人脑的神经活动减弱，表现为认知障碍。AChE 抑制剂可以抑制胆碱酯酶，阻止ACh的水解，从而提高突触间隙中ACh的浓度水平，增加对突触后膜上胆碱受体的刺激，最终提高阿尔茨海默病患者的学习记忆和认知能力[10]。他克林、加兰他敏、多奈哌齐以及利凡斯的明均是常见的胆碱酯酶抑制剂。他克林是第一个获得美国FDA批准用于治疗阿尔茨海默病的药物，属于吖啶类非选择性AChE 抑制剂，但是因为具有外周胆碱能刺激和肝脏毒性作用，临床使用受到很大限制。因此，从天然产物中筛选出具有有效、低毒和价廉等特点的AChE抑制剂意义重大。

肉苁蓉可以补充肾脏的精气和阴阳不足，人参对维持人体正常生命活动有益，黄芪可以补气和增加机体功能，故本课题组研制出防治神经系统疾病的中药复方——肉苁蓉复方制剂，并发现肉苁蓉、人参、黄芪对一些神经系统疾病具有很好的治疗效果。Chen等[11]通过建立大鼠骨质疏松症合并阿尔茨海默病模型，发现肉苁蓉可以提高大鼠的学习记忆能力，增加大鼠的骨密度，进而同时治疗骨质疏松症与阿尔茨海默病。王永炎院士通过多年临床实践基础研发出复方苁蓉益智胶囊(荷叶、肉苁蓉和漏芦)，在北京、天津等多家医院对阿尔茨海默病患者治疗后发现该中成药能够改患者认知功能[12-13]。Luo等[14]通过体内外实验证实了人参具有神经保护作用。刘建春等[15]利用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55 肽段诱导建立实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，通过HE 染色，Western blot 等手段检测黄芪总皂苷对脊髓炎性细胞浸润，髓鞘脱失情况及中枢神经组织中神经营养因子BDNF、GDNF 和GAP-43 的表达变化，发现黄芪总皂苷干预可改善局部神经组织生长的微环境，促进神经营养类物质的表达，从而减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病程度。

AChE 抑制剂可作为多种神经性疾病的一线治疗药物，是抗重症肌无力、青光眼及阿尔茨海默病的重要靶点。为此，我们拟针对AChE，发掘天然产物小分子抑制剂。首先，我们整合多个平台数据，构建了肉苁蓉、人参和黄芪这3 味药物的天然产物小分子虚拟数据库。之后，通过分子对接虚拟筛选技术，从几百个化合物中，成功筛选出了30个最佳的候选天然产物小分子抑制剂。根据筛选出的实验结果，重点考察了槲皮素、山奈酚及染料木素等3 个化合物，结果显示它们的结合能量均远高于已报道的抑制剂，而且类药性也远大于常用阈值，显然它们将是AChE 抑制剂开发的重点研究对象。

基于分子对接药物筛选的结果，我们选取肉苁蓉、人参和黄芪3味药物中结合能量及打分最高的1～2个单体化合物作为研究对象，采用SPR技术对AChE与槲皮素、山奈酚及染料木素进行亲和力检测。结果发现，3个单体化合物均可以与AChE显示出较好的结合力。现有的报道证实了SPR 的结果，槲皮素可通过上调/激活SIRT1 和抑制/失活AChE 来防止氯化镉诱导的海马损伤和记忆丧失[16]。山奈酚可通过GSK3β-Nrf2信号通路，降低AChE 活性发挥对毒死蜱所致大鼠氧化应激和记忆障碍的神经保护作用[17]。同样，染料木素可通过降低大鼠海马组织中AChE 活性，发挥抗氧化和抗炎作用减轻脂多糖诱导的大鼠认知损伤[18]。这些研究也从侧面验证了SPR 实验的有效性。

综上所述，本研究一方面通过分子对接进行药物筛选，获得了槲皮素、山奈酚及染料木素等数个候选的AChE 天然产物小分子抑制剂。另一方面，运用了SPR 技术对分子对接虚拟筛选的结果进行了进一步的亲和力检测。虽然，分子对接药物筛选和SPR亲和力检测研究能够从大量的天然产物中快速地筛选出候选药物并初步揭示药物发挥作用的机制。但是，还需要借助分子生物学、细胞、动物实验和临床试验进行进一步的确证实验。本研究为后续AChE 抑制剂的筛选评价及天然产物小分子抑制剂的研究开发提供思考和启示，也为天然AChE 抑制剂防治多种神经性疾病提供了初步的实验依据。