DHA甘油酯中增塑剂DBP含量的HPLC-MS/MS定性定量分析

＊谭新 陈迪 彭小雨 潘丽娜 李威 汪家琦

（1.湖南万全裕湘生物科技有限公司 湖南 411300 2.澳优乳业（中国）有限公司 湖南 410000）

DHA甘油酯中增塑剂邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）的含量，是一个重要的控制指标，DBP具有影响生殖、阻止发育等毒性[1]，由于DBP等增塑剂不会与聚合物发生化学结合，而是以自由移动和可浸出相的形式存在，因此，DBP可能会被浸出或从封闭的材料迁移到食品和饮料中。

目前对食品中邻苯二甲酸酯增塑剂的测定采用的是气相色谱-质谱联用（GC-MS），第一法是在试样中加入氘代邻苯二甲酸酯作为内标物，各类食品经提取、净化后进行GC-MS测定，采用特征选择离子监测扫描模式（SIM），同位素内标法定量，第二法是采用外标法定量；以及彭琪等[2]报道的气相色谱-质谱联用（GC-MS）法沙刺籽油中塑化剂DBP含量的测定和祝伟霞等[3]采用大气压化学电离-液相色谱串联质谱法测定油基食品中的18种邻苯二甲酸酯类化合物等。

本文建立了电喷雾电离-HPLC-MS/MS定性定量分析DHA甘油酯中DBP的方法，并对DHA甘油酯生产中的各种介质和材料中DBP的含量进行了定量分析，探究了引起产品DHA甘油酯DBP含量升高的主要原因。

1.实验部分

（1）仪器与试剂。本实验所使用的主要仪器：UFLC-MS8045超高效液相色谱-串联质谱仪，AP124Y电子天平，日本岛津公司；明杰Smart-S15UV超纯水仪，湖南启沁环保科技有限公司；KM5200FB超声波清洗仪，昆山美美超声仪器有限公司；TG16K-11高速离心机，长沙市东旺实验仪器有限公司；HJ-5多功能磁力搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；DRZ-4马弗炉，长沙实验电炉厂；SHB-IV循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

实验所使用的主要试剂和玻璃器皿：

邻苯二甲酸二正丁酯，99.81%，Stanford Analysis Chemicals；甲醇、乙腈，GR，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙醇，AR，湖南汇虹试剂有限公司；金龙鱼油（1:1:1）1.8L，益海嘉里（岳阳）粮油工业有限公司；DHA甘油酯和工艺材料等实验样品，湖南万全裕湘生物科技有限公司。

实验研究中用到的容量瓶、玻璃滴管、玻璃具塞离心管、烧杯、量筒、玻璃移液管等玻璃器皿，均经过无水乙醇清洗后，置于马弗炉中450℃焙烧4h，消除来自实验、溶剂等残留的DBP干扰。

（2）标准溶液的配制。使用玻璃滴管精确称量0.0212g DBP标准品于10mL烧杯中，加入乙腈溶解后转移至500mL容量瓶中，多次使用乙腈洗涤烧杯，将溶液转移至500mL容量瓶中，使用乙腈稀释，定容，配制成42.4mg/L的DBP母液，超声10min，待用。

使用玻璃移液管移取一定体积的DBP母液，配制成浓度为21.6μg/L、43.2μg/L、86.4μg/L、216μg/L、432μg/L、648μg/L、1080μg/L、1296μg/L、1728 μg/L、2160μg/L的标准溶液，进行HPLC-MS/MS分析。

（3）样品制备。使用玻璃滴管称取约1.00g样品于10mL玻璃离心管，加入2mL乙腈，涡旋1min，超声提取20min，在离心机中以4000r/min的转速离心4min，收集上清液于10mL容量瓶中。底液中加入2mL乙腈，重复提取4次，乙腈定容至刻度线，待HPLC-MS/MS分析。

（4）工艺材料处理。对DHA甘油酯生产工艺过程中所用到的材料，用金龙鱼鱼油作模拟介质，进行处理后得到分析样品，以考察增塑剂DBP的带入可能性。

①金龙鱼鱼油空白处理。量取6mL金龙鱼油于10mL具塞玻璃离心管中，将离心管置于80℃水浴中，水浴4h。

②包装用铝瓶、生产过程中用到的胶管、滤布、垫圈、白土、溶液和酯化酶的预处理。

分别称取一定的量，用一定量的金龙鱼油浸，置于80℃水浴中，水浴4h。

③液液萃取。称取1.00g上述处理后的鱼油于10mL玻璃离心管中，加入2mL乙腈，涡旋1min，超声提取20min，4000r/min离心4min，收集上清液。残液中再加入2mL乙腈重复提取4次，合并上清液。将萃取溶液置于真空干燥箱，60℃浓缩至干，加入乙腈定容至2mL，待HPLC-MS/MS分析。

（5）液相色谱串联质谱条件。液相色谱条件：Shimadzu UFLC-MS8045，配二极管阵列检测器（DAD）；色谱柱：Shimadzu Shim-pack GIST C18（150mm×2.1mm，5μm）；流动相：水（A）：乙腈（B），梯度洗脱程序；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；检测波长：224nm；进样量：10μL。

质谱条件：三重四级杆质谱仪，配电喷雾电离源（ESI），正离子多反应监测扫描（MRM）；雾化气流量：3L/min；加热器流量：10L/min；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥器流量：10L/min；检测时间：0～15min；保留时间、离子对、碰撞能量见表1。

表1 质谱保留时间、离子对、碰撞能量数据表

2.结果与讨论

(1)样品制备方法优化

①萃取溶剂的选择

食品中DBP的提取溶剂通常是乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、丙酮等。考虑到流动相体系，并不进行净化、浓缩等步骤，本实验考察甲醇和乙腈作为溶剂对DHA甘油酯中DBP的提取率，结果如表2所示。乙腈的提取率远高于甲醇，本实验选择乙腈作为提取溶剂。

表2 甲醇和乙腈对DHA甘油酯中DBP的提取效率

②乙腈溶剂的干扰

有机溶剂中通常会存在一定量的DBP。本实验室考察了乙腈空白中DBP含量的影响，乙腈和浓度为4.24μg/L的DBP标准溶液的MRM质谱图如图1所示，峰面积分别为82973和257582。因此，乙腈溶剂中DBP会对样品中DBP的定量造成一定的干扰，本实验为了降低空白DBP的干扰，仅做最低限度的样品处理，并控制所有样品和标准品进样体积为10μL，稳定空白值。

图1 乙腈空白和DBP标准溶液的MRM色谱图

图2 塑料移液管的干扰

③萃取次数的选择

液液萃取是利用物质在两种互不相溶或微溶的溶剂中溶解度或分配系数不同，是物质从一种溶剂转移至另外一种溶剂中。经过多次萃取，将大部分物质提取出来。本实验考察了乙腈不同萃取次数对低DBP含量（A3）和高DBP含量（A4）的DHA甘油酯的影响，结果如图3所示。经过3次萃取，DHA甘油酯样品中大部分DBP被萃取出来，低含量的样品中DBP被完全萃取。考虑到有高含量的样品存在，为提高数据可靠性，本实验选择乙腈液液萃取5次。

图3 乙腈萃取次数对DBP萃取率的影响

（2）标准曲线、线性范围和检出限。本方法采用外标法定量，依据检测样品响应值，配制一系列DBP标准样品，按照优化后色谱-质谱条件进行MRM检测，以DBP标准品浓度（x，μg/L）对DBP响应峰面积（y）绘制标准曲线如图4。取DBP标准样品逐级稀释，按照3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比，测定方法的DBP定性限和定量限。方法的线性方程、相关系数、线性范围、定性限和定量限见表3。

图4 DBP的标准曲线

表3 方法的线性方程、相关系数、线性范围、定性限和定量限

（3）加标回收率和方法精密度。量取一定体积的DBP母液稀释成5.0880mg/L的DBP标准溶液，作为加标回收实验的标准溶液。精确称取3份1.0000g已知DBP浓度的DHA甘油酯样品于10mL玻璃离心管中，向3份样品中分别加入5.0880mg/L的DBP标准溶液0.05mL、0.10mL、0.15mL，根据样品制备步骤和HPLCMS/MS方法测定DBP含量，每个添加水平重复6次进样检测，计算加标回收率和相对标准偏差（RSD）。

（4）样品中DBP的测定。根据实验优化样品制备方法和工艺材料处理方法和色谱-质谱条件，对2个工艺中间样品、2个酯化物样品、7个DHA甘油酯样品进行DBP检测。在排查和处理引起DBP迁移的材料，最终DHA甘油酯产品的DBP含量降至0.11mg/kg以下，低于我国食品中DBP允许最大残留量为0.3mg/kg的规定。

通过模拟实验，对工艺材料进行DBP迁移率探究，找到了引起DHA甘油酯样品中DBP含量升高的主要原因。

3.结论

（1）建立了DHA甘油酯中增塑剂邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）的RP-HPLC-MS/MS定性定量分析方法。使用乙腈液液萃取提取样品中的DBP，经液相色谱分离，正离子模式下多反应监测扫描（MRM）检测，外标法定量。液相色谱条件如下：ShimadzuUFLC-MS8045，配二极管阵列检测器（DAD）；色谱柱：ShimadzuGISTC18（140mm×2.1mm，5μm）；流动相：水（A）：乙腈（B），梯度洗脱；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；检测波长：224nm；进样量：10μL。MRM质谱条件如下：三重四级杆质谱仪，配ESI电离源，正离子多反应检测扫描（MRM）；雾化气流量：3L/min；加热器流量：10L/min；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥器流量：10L/min；检测时间：0～15min。该方法建立的标准曲线，线性范围为21.6～2160μg/L，线性相关系数为0.9994，定性限为0.18μg/L，定量限为0.59μg/L，标准加标回收率为86.31%～114.08%，RSD为1.70%～6.10%，满足本实验的DBP定量分析需求。

（2）使用本分析方法对10种样品和29种工艺材料中DBP进行定量分析，发现了引起产品DBP升高的原因，经过改进工艺，使最终DHA甘油酯产品中DBP含量低于0.11mg/kg，符合我国食品安全规定食品中DBP允许最大残留量0.3mg/kg，分析方法对指导工艺生产具有重要意义。