基于UHPLC法的巨豆三烯酮前体物同分异构体的定量分析及其在不同产地烟叶中的分布情况

李石头,毕一鸣,帖金鑫,杨晨,李庆祥,李永生,杨鹏飞,毛多斌

1.浙江中烟工业有限责任公司 技术中心,浙江 杭州 310000;2.郑州轻工业大学 烟草科学与工程学院,河南 郑州 450001

0 引言

巨豆三烯酮是一种重要的中性香味成分,具有甜润的烟草香、干果香和辛香底韵,且在卷烟中具有增香提质、降低杂气的作用[1-2]。天然产物中的巨豆三烯酮含有5种同分异构体,分别为(4, 6Z, 8Z)-巨豆三烯酮、(4, 6E, 8Z)-巨豆三烯酮、(4, 6Z, 8E)-巨豆三烯酮、(4, 6E, 8E)-巨豆三烯酮和(4, 7E,9)-巨豆三烯酮[3-4],这些物质均产自类胡萝卜素的降解与代谢过程[5-7]。烟叶在生长早期会积累类胡萝卜素以保护烟叶组织免受氧化应激胁迫[8],而类胡萝卜素可直接降解或通过糖基化中间体产生巨豆三烯酮。其中,通过糖基化中间体产生的巨豆三烯酮主要以没有香味的糖苷态存在,并在烟叶发酵和燃烧过程中通过酶解和热解反应释放糖苷配基3-氧代-α-紫罗兰醇,该醇可进一步脱水重排生成巨豆三烯酮[9-10]。

巨豆三烯酮具有较多糖苷前体物[11-12],在烟草中以3-氧代-α-紫罗兰醇-β-D-吡喃葡萄糖苷(OIPG)的含量较高[13]。OIPG 有两种同分异构体,分别为(6R, 9R)-3-氧代-α-紫罗兰醇-β-D-吡喃葡萄糖苷(rrOIPG)和(6R, 9S)-3-氧代-α-紫罗兰醇-β-D-吡喃葡萄糖苷(rsOIPG)[14]。烟草中糖苷类物质的分析多采用间接分析方法,即对糖苷类物质先进行酶水解或酸水解,再使用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对释放的苷元进行分析[15-17];也有少数使用中心切割反相/反相二维液相色谱-质谱[18]、高效液相色谱-质谱联用[19-20]等技术直接进行检测,但上述方法使用的仪器昂贵,操作较复杂,且不能有效区分同分异构体。目前,尚未见利用超高效液相色谱(UHPLC)法对这两种同分异构体进行定量分析的报道。鉴于此,本研究拟以烟叶中rrOIPG和rsOIPG为研究对象,建立超声辅助萃取- UHPLC法对其进行定量检测,并对国内外7个产地烟叶中rrOIPG和rsOIPG的含量进行对比分析,以期明确巨豆三烯酮两种香味前体物对卷烟香气的贡献,进而为卷烟产品加香的精细调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

主要材料:云南玉溪C3F、河南南阳B2F、四川凉山B2F、津巴布韦、巴西MBO-GX、加拿大CAO118CHC和美国2019BF1M,浙江中烟工业有限责任公司。

主要试剂:rrOIPG和rsOIPG标准品、异落叶松脂醇-9-O-β-D-葡萄糖苷,结构经核磁共振波谱表征,纯度均大于97%,郑州轻工业大学实验室;二氯甲烷(分析纯),中国医药集团有限公司;甲醇、乙腈,均为色谱纯,美国Fisher Chemical公司;超纯水,杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 主要仪器与设备

BSA323 S型电子天平(感量0.000 01 g),上海赛多利斯天平仪器厂;Bruker 600 MHz型超导核磁共振波谱仪,瑞士布鲁克拜厄斯宾(北京)有限公司;Bond Elut C18型固相萃取小柱,安捷伦科技(上海)有限公司;ACQUITY UPLC I-Class型UHPLC仪、ACQUITY PDA型二极管阵列检测器,沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理将烟叶于45 ℃条件下烘干、粉碎,过40目筛网,量取5.00 g烟末与100 mL二氯甲烷,于25 ℃、100 W条件下超声处理20 min,过滤,将所得烟末置于45 ℃烘箱中烘干至恒重;精准称取2.500 0 g上述烟末,与100 mL甲醇在同样条件下经超声萃取后,取滤液减压浓缩并定容至5 mL;取1 mL上述液体以0.5 mL/min的流速通过预活化的固相萃取小柱,待液体全部流入小柱后,用体积分数为20%的乙腈水溶液洗脱,取第3～4 mL洗脱液用于下一步分析;取450 μL洗脱液,加入50 μL内标溶液,过0.22 μm滤膜后,待检测。

1.3.2 方法学验证标准溶液配制和检出限测定:称取一定量的rrOIPG和rsOIPG标准品,用超纯水稀释后配制成质量浓度分别为0.5 mg/mL和0.2 mg/mL的A储备液和B储备液;称取一定量的异落叶松脂醇-9-O-β-D-葡萄糖苷,配制成质量浓度为1 mg/mL的内标溶液,并配制9个不同质量浓度梯度的系列标准溶液。其中,rrOIPG质量浓度梯度为25.85 μg/mL、51.70 μg/mL、77.55 μg/mL、103.40 μg/mL、129.25 μg/mL、155.10 μg/mL、206.80 μg/mL、232.65 μg/mL和 258.50 μg/mL,rsOIPG质量浓度梯度为6.28 μg/mL、12.55 μg/mL、18.82 μg/mL、25.10 μg/mL、31.38 μg/mL、37.65 μg/mL、43.92 μg/mL、50.20 μg/mL和62.75 μg/mL。利用UHPLC仪对上述标准溶液进行检测,以rrOIPG和rsOIPG峰面积与内标峰面积之比为横坐标(x)、样品质量浓度为纵坐标(ρ)绘制标准曲线。根据信噪比(S/N)为3的计算方法测定检出限。

精密度实验:取1.3.1中的待测样,于UHPLC仪中连续进样6次,对rrOIPG和rsOIPG的色谱峰进行积分并计算相对标准差(RSD)。

稳定性实验:取1.3.1中的待测样,分别在0 h、6 h、12 h和24 h时于UHPLC仪上样,对rrOIPG和rsOIPG的色谱峰进行积分并计算RSD。

重复性实验:使用同一种烟末,按1.3.1的方法重复处理6次后于UHPLC仪上样,对rrOIPG和rsOIPG的色谱峰进行积分并计算RSD。

加标回收实验:准确称取3份经二氯甲烷处理后的烟末样品进行加标回收实验,其中rrOIPG和rsOIPG标准品添加量分别为400 μg和60 μg,采用内标标准曲线法进行定量分析。

1.3.3 分析条件色谱柱为Waters ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm);柱温为25 ℃;流动相为体积比90∶10的乙腈-乙酸水溶液(乙酸体积分数为0.1%);检测器为PDA检测器,检测波长为242 nm;流速为0.4 mL/min;进样量为2.5 μL。

1.3.4 数据处理每组实验平行测定3次,实验结果以平均值表示,利用R语言对数据进行主成分分析,采用Origin 2020制图。

2 结果与讨论

2.1 烟末样品的UHPLC谱图分析

烟末样品的UHPLC谱图见图1。由图1可知,经1.3.1前处理得到的烟末样品色谱峰形态良好,目标化合物rrOIPG和rsOIPG色谱峰能达到基线分离,适合进行定量测定。

图1 烟末样品的UHPLC谱图Fig.1 UHPLC chromatogram of tobacco powder sample

2.2 方法学考察

rrOIPG和rsOIPG的标准曲线见图2。由图2可知,rrOIPG的线性方程为ρ=58.03x+7.802 1,R2=0.999 1;rsOIPG的线性方程为ρ=93.953x+3.760 9,R2=0.999 0,分别在25.85～258.50 μg/mL和6.28～62.75 μg/mL内具有良好的线性关系,且检出限分别为2.5 μg/mL和2.9 μg/mL。

图2 rrOIPG和rsOIPG的标准曲线Fig.2 The diagram of standard curves of rrOIPG and rsOIPG

根据精密度实验结果可知,rrOIPG和rsOIPG的RSD分别为0.32%和0.43%,说明仪器精密度较高。

根据稳定性实验测定结果可知,rrOIPG和rsOIPG的RSD分别为0.70%和1.20%,说明根据1.3.1制备的待测样品溶液在24 h内相对稳定。

根据重复性实验结果可知,rrOIPG和rsOIPG的RSD分别为1.47%和1.90%,说明该方法重复性良好。

由加标回收实验结果可知,rrOIPG和rsOIPG的加标回收率分别为83.94%和105.90%,RSD分别为1.22%和1.93%,表明该方法具有稳定的回收率和准确性,可用于烟叶中rrOIPG和rsOIPG含量的测定。

2.3 不同产地烟叶中rrOIPG和rsOIPG含量分析

7个产地烟叶中rrOIPG和rsOIPG的含量见图3。由图3a)可知,rrOIPG在7个产地的含量分布差异较大,其中含量最高的产地是巴西(303.0 μg/g),其次为河南(281.3 μg/g),最低的是津巴布韦(84.8 μg/g)。由图3b)可知,rsOIPG在四川和云南烟叶中未检出,在河南烟叶中微量存在,而在国外产地的烟叶中大量存在。值得注意的是,尽管津巴布韦烟叶中rrOIPG含量最低,但rsOIPG含量较高。

图3 7个产地烟叶中rrOIPG和rsOIPG的含量Fig.3 The content of rrOIPG and rsOIPG in tobacco leaves from seven regions

7个产地烟叶中rrOIPG和rsOIPG的含量分布见图4。由图4可知,rrOIPG和rsOIPG的含量差异使国内外产地烟叶的置信区间在主成分分析上有明显区分,这可能是国外优质烤烟感官品质总体上优于国内烤烟的原因之一。

3 结论

本文以OIPG两种同分异构体(rrOIPG和rsOIPG)为研究对象,建立了超声辅助萃取-UHPLC法直接检测烟叶中rrOIPG和rsOIPG含量的方法,即烟叶经二氯甲烷预处理、甲醇超声萃取和C18固相萃取小柱富集纯化后,便可在UHPLC仪中达到良好的分离效果;该方法线性关系良好,仪器精密度较高,样品的稳定性和重复性较好,rrOIPG和rsOIPG的加标回收率分别为83.94%和105.90%,RSD分别为1.22%和1.93%。本研究方法可行性较高,前处理步骤简单,适用于烟叶中rrOIPG和rsOIPG的定量分析。使用该方法测定了国内外7个产地烟叶中rrOIPG和rsOIPG的含量分布,发现国内外烟叶样品中rrOIPG和rsOIPG含量分布差异较大,其中国外产地烟叶中rsOIPG含量明显高于国内产地烟叶,且国内外产地烟叶中rrOIPG的含量均高于rsOIPG。目前,业界尚未见有关OIPG两种构型区分的报道,故本研究结果可为巨豆三烯酮香味前体物的研究提供理论基础。