椰子油对海南黑山羊羔羊瘤胃上皮发育的影响

施力光,张 雨,吴灵丽,曹 婷,侯冠彧,周汉林

(1.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所,海南 儋州 571737;2.山西农业大学 动物科技学院,山西 太谷 030801;3.中国热带农业科学院 湛江实验站,广东 湛江 524013)

瘤胃作为反刍动物摄入饲草料的“处理工厂”,70%以上的可消化物质和50%以上的粗纤维都能够通过瘤胃微生物的发酵和降解转化成能被其自身利用的营养物质,因而瘤胃结构和功能的完整是反刍动物正常生长发育以及产肉产奶的重要保障。瘤胃上皮(乳头)作为瘤胃发酵机能重要的功能单元,与反刍动物生长发育及其生产性能表现密切相关[1]。研究已证实,新生的幼龄反刍家畜瘤胃未发育完全,随着日龄增长和植物性饲料的摄取,瘤胃的功能才日趋完善,幼龄反刍动物瘤胃发育的形态学对营养物质消化代谢和成年后生产性能的发挥具有重要参考意义,且断奶日龄[2]、饲料组成[3]、瘤胃内环境[4]、疾病和中毒等[5]因素都会影响反刍动物瘤胃上皮的发育。Sun等[6]通过断奶前绵羊开食料的诱食使瘤胃上皮IGF-I和cyclin mRNA表达水平增加,进而促进瘤胃上皮发育;Debruyne等[7]在羔羊饲料中添加椰子油对瘤胃发育有显著的刺激作用和抑制甲烷生成的调控效果;闫小兰等[8]通过改变羔羊饲粮的氮硫比有效地促进瘤胃发育和改善羔羊瘤胃微生物区系结构;Wang等[9]在犊牛日粮中添加皂甙也改变了微生物的定植并产生持久影响。椰子油是一种富含大量中短链饱和脂肪酸植物油脂,可直接通过自由扩散的形式被肠道上皮吸收,既可以作为一种饲料营养成分添加使用,又能作为功能性添加剂调控瘤胃机能性。然而关于椰子油调控幼龄家畜瘤胃发育的研究相对较少。基于此,在课题组前期体外模拟发酵试验证实椰子油对体外发酵有明显调控效果的基础上[10],本试验以海南黑山羊羔羊为研究对象,在日粮中添加椰子油,观察瘤胃早期发育的影响,以期为早期营养干预幼龄反刍动物瘤胃发育提供基础数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

选用24只10日龄海南黑山羊羔羊,平均体重2.05±0.16 kg,体质健康,由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海南黑山羊种羊场提供。试验羔羊随机分成4个处理,每组6个重复,Ctrl组为对照组,仅饲喂基础日粮,LCO组饲喂基础日粮+4 g/d椰子油,MCO组饲喂基础日粮+6 g/d椰子油,HCO组饲喂基础日粮+8 g/d椰子油。基础日粮组成为代乳粉+精料+鲜王草,代乳粉购于北京精准动物营养研究中心,椰子油购于海南品椰品实业有限公司。精料由种羊场自配,组成成分及营养水平见表1。试验饲养周期90 d,分2个阶段进行,10～70日龄采用人工哺乳的方式专人负责定时投喂,其中代乳粉经温水溶解后,饲喂量为羔羊体重的2 %,椰子油通过一次性注射器直接饲喂到羔羊口中,精料和鲜草则按照50∶50的比例(干物质基础)提供给羔羊自由采食,每日饲喂2次,晨饲07:00,晚饲17:00,自由饮水。70日龄断奶后,除停止饲喂代乳粉,饲养管理同前。

表1 日粮组成及营养水平(干物质基础)

1.2 样品采集

90 d试验期结束后,每个组6只羔羊全部屠宰,按照赵有璋[11]的方法,宰前禁食禁水称重,颈静脉放血致死后剥离毛皮进行常规屠宰性能测定。瘤胃清除内容物后选取背囊和腹囊中心区域约2 cm2样品5～6块,PBS冲洗后进行乳头计数和密度测定,另取1 cm2瘤胃组织4%多聚甲醛室温固定24 h,用于切片制作。

1.3 瘤胃器官指数和体积测定

瘤胃内容物清空后,将幽门扎紧,从贲门处向瘤胃内充满自来水,用量筒测定用水体积,记为瘤胃体积;瘤胃器官指数为瘤胃重占宰前活重的百分比。

1.4 瘤胃上皮乳头密度测定

准确量取2 cm2的瘤胃上皮,体视镜下计数乳头的数量,每只羔羊体测定5个重复,连续计数后取平均值记为瘤胃上皮乳头密度。

1.5 瘤胃上皮形态学观察

经4%多聚甲醛固定的瘤胃上皮,使用梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋后,修成立方体蜡块,5 μm厚度切片、展片、贴片,再经二甲苯脱蜡,梯度乙醇复水,H.E.染色,梯度乙醇脱水,中性树脂封片,光镜下观察拍照。用Image-Pro 6.0图片分析软件测定乳头的长度和宽度,每只羔羊个体测定5张切片,每张切片3个视野,每个视野读数5个数据,分别统计每组6只羔羊5个重复对应的单位面积内乳头长度×宽度之和进行计算乳头表面积。

1.6 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 椰子油对羔羊瘤胃重量和体积的影响

由表2可知,在日粮中添加6 g/d的椰子油,90日龄屠宰时羔羊瘤胃体积显著的大于对照组、低剂量和高剂量椰子油添加(P<0.05),瘤胃重量则不受椰子油添加的影响,瘤胃指数差异不显著(P>0.05)。

表2 椰子油对羔羊瘤胃重量和体积的影响

2.2 椰子油对瘤胃上皮乳头性状的影响

对瘤胃上皮H.E切片染色的光镜观察和统计结果见表3。由表3可知,在日粮中添加椰子油对瘤胃上皮乳头的长度和宽度没有显著的影响(P>0.05),计算单位面积内乳头的数量,发现HCO组上皮乳头密度极显著降低(P<0.01),乳头表面积在HCO和Ctrl组也显著降低(P<0.05),羔羊日粮中添加4～6 g/d椰子油,瘤胃乳头表面积增加了约20%。

表3 椰子油对羔羊瘤胃乳头性状的影响

2.3 椰子油对瘤胃上皮细胞结构的影响

光学显微镜下不同处理组瘤胃上皮的组织形态学结构如图1和图2所示,对照组黏膜结构完整,角质层(SC)光滑无明显增生,颗粒层(SG)和棘突层(SS)细胞分解不明显(图1A、图2A);随着日粮椰子油剂量的增加,图1B、图1C颗粒层(SG)和棘突层(SS)的细胞层数增多,图2B基底层(SB)增厚,尤其是角质层(图2C)出现了明显的增厚,图1D和2D无色的角质化细胞(SC)增多明显,在6～8 g/d椰子油添加的羔羊瘤胃乳头上皮黏膜也出现了无规则的卷曲或增厚。

图1 瘤胃上皮石蜡切片H.E.染色(100×)

图2 瘤胃上皮石蜡切片H.E.染色(200×)

瘤胃乳头上皮角质层、颗粒层、棘突层和基底层高度的测量结果如表4所示,添加椰子油能够显著增加角质层的厚度(P<0.05),颗粒层细胞厚度在Ctrl组和MCO组无显著差异(P>0.05),LCO组和HCO组细胞层厚度显著增加(P<0.05),棘突层在对照和低剂量椰子油组无差异,6～8 g/d椰子油添加显著增加了棘突层细胞的数量。

表4 椰子油对羔羊瘤胃上皮乳头细胞结构的影响

3 讨 论

椰子油是富含大量中长链饱和脂肪酸的天然油脂,丰富的月桂酸(母乳中油脂的主要成分)有利于幼龄动物肠道的吸收和利用[12],且对瘤胃发育有明显的刺激效果[13]。卢劲晔[14]发现使用高能量水平饲料能显著增加青年波尔山羊瘤胃干重,但对瘤胃湿重无影响;冯丹等[15]在湖羊日粮中添加不同比例桑叶粉对瘤胃增重影响显著。本试验中添加椰子油对羔羊瘤胃重量变化影响不显著,综合考虑瘤胃指数,可能是由于断奶日龄稍晚、断奶后养殖时间较短造成,因为有研究表明羔羊进入育肥阶段后平均日增重和器官指数变化趋势受到日粮组成变化而发生反转[16]。瘤胃的体积随着椰子油添加量增加而增大,与Tümmler等[17]结果一致。本试验中8 g/d椰子油对瘤胃体积变化无显著影响,推测可能由于添加过高能量的椰子油造成羔羊采食量下降[18],降低了摄入饲粮对瘤胃的填充刺激所造成。

瘤胃上皮乳头大约从15～56 d开始逐渐发育,母乳或代乳粉等液体日粮会限制幼畜瘤胃上皮形态结构和生理功能的发育[16]。Carballo等[19]报道羔羊早期断奶会造成瘤胃上皮乳头高度、宽度、面积和肌层等厚度的降低,而赵雅轩等[20]报道早期断奶日龄不同只影响瘤胃乳头长度,对其他上皮参数影响不明显。本试验中瘤胃上皮乳头长度和宽度都未受到椰子油添加的影响,但能够增加瘤胃乳头面积(添加量4～6 g/d),与卢劲晔[14]报道的高能量日粮能增加瘤胃重量同时增加上皮乳头长度和乳头表面积略有差异。在瘤胃形态学研究中,瘤胃乳头长度直接决定对粗纤维饲料附着力,而不同日粮组成、添加剂对瘤胃上皮乳头的影响差异大相径庭[21-22],推测是由于本试验日粮中除了添加的代乳粉外,诱食的精料和鲜草日粮组成同时有效地刺激了对照组羔羊瘤胃上皮的发育造成。因为对幼龄反刍动物而言,摄入的固体饲料除具有物理刺激作用外,还可促使瘤胃微生物的发酵功能逐渐建立并产生多种代谢物质。挥发性脂肪酸(VFAs)是刺激瘤胃上皮细胞和乳头形态学发育的关键营养素,尤其是丁酸能够刺激瘤胃上皮细胞周期由G0/G1期向S期推进,细胞在S期可完成DNA复制进行增殖,进而增加瘤胃乳头发育,椰子油中含中、短链脂肪酸的比例达60%以上,是低碳脂肪酸(丁酸)最丰富的来源,进而通过羔羊瘤胃代谢影响上皮乳头形态学发育。高能量日粮对采食量的抑制会弱化日粮对瘤胃上皮的刺激,相应延缓瘤胃上皮的增殖和发育,这也解释了高添加量的椰子油会造成瘤胃上皮乳头密度极显著降低的结果。

瘤胃上皮的细胞结构从瘤胃腔内向外依次是角质层、颗粒层、棘突层和基底层。一般认为棘突层和基底层细胞是吸收代谢的主要场所,因为超微结构观察棘突层上皮细胞存在着丰富的细胞器结构,而且线粒体数量较多,细胞代谢作用强。本试验观察到添加椰子油后颗粒层和棘突层细胞明显增厚,这与Sun等[6]、卢劲晔[14]、Ragionieri等[23]分别在羔羊、青年羊、犊牛上的研究报道一致,高的能量水平、瘤胃发酵剂及推迟的断奶日龄均能促进瘤胃上皮细胞的发育。棘突层是短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)代谢的重要细胞结构,来源于瘤胃微生物发酵的乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸能够直接参与细胞的代谢,尽管中链饱和脂肪酸能否被棘突层和基底层上皮细胞直接吸收利用还未验证,但从C8～C12在幼畜肠道不需要形成乳糜微粒就能被上皮细胞所吸收来看,推测椰子油是能被瘤胃上皮细胞直接吸收进而刺激棘突层和基底层细胞增殖的。而且颗粒层和棘突层细胞大量线粒体产生的ATP水解后释放的能量被跨膜蛋白Na+/K+-ATP酶利用,以增强细胞膜内外的离子平衡和代谢活性,进而影响到的消化和分泌机能。本试验中还观察到添加椰子油后,瘤胃乳头上皮的角质层明显增厚,角质层细胞由桥粒相连接而形成,Xu等[24]在高谷物日粮饲喂的绵羊瘤胃上皮也观察到角质层细胞的明显增厚,可见,瘤胃上皮对营养物质的转运吸收在很大程度上依赖于角质层细胞的保护和防御作用,过厚的角质层或者角质化不全会引起乳头退化而不利于营养物质吸收的说法有待深入研究。

4 结 论

在本试验条件下,MCO组(基础日粮+6 g/d椰子油)瘤胃的容积显著增加,MCO组和LCO组(基础日粮+4 g/d椰子油)瘤胃上皮乳头表面积增大,HCO组(基础日粮+8 g/d椰子油)乳头角质层细胞明显增厚。羔羊日粮中添加6 g/d椰子油能一定程度刺激瘤胃上皮乳头细胞层的增生,促进羔羊瘤胃的发育。