抗生素抗性基因及其消除策略

李 奎,周心晨,韩新燕

(1.浙江省畜牧技术推广与种畜禽监测总站,浙江 杭州 310017;2.海南浙江大学研究院,海南 三亚 572000;3.浙江大学 动物科学学院,浙江 杭州 310058)

自1929年青霉素面世以来,抗生素这类由某些微生物在生活过程中产生的、对某些其他病原微生物具有抑制或杀灭作用的化学物质,逐渐走入大众视野。由于其抑菌和促生长的特性,抗生素被广泛应用于人类医疗和畜牧生产中。在近一个世纪中,为改善人类及动物健康作出了巨大贡献。然而,抗生素在帮助动物对抗病原菌感染和扩散的同时,也带来了药物残留和耐药性的问题,会造成环境污染,并且能作用于肠道菌群,影响动物健康。

为了维护人类、动物健康和良好生态环境,各国开始限制、禁用饲用抗生素。中国也积极响应,自2020年元旦起就已停止生产和进口相应兽药产品,注销抗生素兽药产品的批准文号和进口兽药注册证书,同年7月1日起禁止所有促生长类药物饲料添加剂(除中药外)的生产[1]。

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)是使抗生素作用效果减弱的“罪魁祸首”。ARGs是微生物携带的可使其暴露于一种或多种抗生素环境中而不被杀死的基因。经过研究,ARGs的产生、种类和耐药机制都已被逐步探明,检测方法也随着时代发展不断进步。随着粘菌素抗性基因mcr被发现及其在人畜间和社区间的传播性被证实,“最后一道防线”粘菌素被突破[2-4]。在无抗生素可用的风险下,抗生素抗性基因消除策略成为当下及未来一段时间内的研究热点。本文系统总结了21世纪以来ARGs的消除策略,以期为该领域的后续研究提供理论参考。

1 ARGs作用机制

1.1 ARGs的产生

从进化生态学的角度考虑,大多数临床抗生素是在药用抗生素使用时代之前就存在的天然微生物产物的衍生物,通常存在于土壤微生物的化学库中。相应地,对这些化合物的耐药性也是在很久以前的自然环境中进化出来的[5]。耐药菌和敏感菌在土壤环境中共存了很长时间,但没有占据主导地位。抗生素抗性基因可分为固有抗性和获得性抗性2种类型。固有抗性是指细菌本身通过遗传获得的抗性基因序列,是微生物在长期进化过程中获得的对抗生素表现出抗性的性状。而获得性抗性是指微生物通过水平转移方式从外界获得的抗性基因序列,在自身体内表达而产生的抗生素抗性性状。一般地,细菌自发突变的概率为10-6～10-8,而且很不稳定,而突变获得对不同药物的多重抗生素抗性的概率更低[5]。因此在抗生素的选择压力条件下,通过质粒、整合子和转座子等载体介导的抗性基因的水平转移是造成今天抗性基因广泛传播的的重要原因[6]。

1.2 ARGs的种类

目前,我国养殖场废水、污水处理厂、河流、细菌体内、饮用水、沉积物、土壤、空气等不同的环境介质中,至少已发现有39种四环素类抗性基因(tet)、4种磺胺类抗性基因(sul)和10种β-内酰胺类抗性基因(NDM-1),以及部分喹诺酮类抗性基因(qnr)、大环内酯类抗性基因(erm)和整合基因(int)[7]。

1.3 ARGs的发现方法

20世纪90年代,分子生物学技术和设备的出现与传播使人们发现了新ARGs和许多变体。传统的鉴定方法包括克隆、诱变、转座子诱变、功能基因组学方法等。到了下一代测序时代,DNA测序的成本下降,可通过全基因组测序、宏基因组、功能宏基因组学方法分离和检测新ARGs。在将下一代测序引入临床微生物学时,数据分析成了主要挑战。生物信息学分析工具的发明与应用使ARGs发现进入生物信息学时代。此时可使用电阻分析、蛋白质建模、目的基因的合成等方法来预测新的ARGs,但仍需经过生物学验证[8]。

1.4 ARGs的耐药机制

ARGs主要有3个作用机制:一是细菌外膜孔蛋白基因的突变和表达水平的降低,降低孔蛋白对抗生素的敏感性,从而降低细菌外膜的通透性,减少药物进入细菌,并在染色体编码的外排泵的协同作用下,外排抗生素,使细胞内抗生素浓度下降;二是基因突变或翻译后修饰原本对抗生素具有高亲和力的作用靶点,降低抗生素作用靶点对抗生素的亲和力,同时不影响靶点的正常功能;三是编码修饰酶或水解酶,给抗生素加上基团来改变其结构,或者水解破坏抗生素结构,使抗生素失活[9-11]。

2 ARGs的消除策略

2.1 物理和化学方法

2.1.1 吸附法 过去人们考虑ARGs的消除策略时,更多是从环境的角度,减少环境废水和空气中的抗生素残留,因此发明了一系列物理、化学方法。关于使用金属或纳米粒子、碳纳米管和沉积物吸附去除抗生素的研究很多[12-15]。然而,天然或改性吸附剂在经济可行性、适用性、去除效率和再生方面都存在缺陷。Aydin等[16]评估了四氧化三铁-赤泥-纳米粒子从传统市政污水处理厂收集的污水样品中去除抗生素的吸附效果,发现这种吸附剂具有良好的效果。在该研究中,通过间歇吸附试验研究了四氧化三铁-赤泥-纳米粒子吸附剂的赤泥含量、pH、接触时间、吸附剂用量、温度和其他参数对环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)的影响。根据之前的分析,四氧化三铁-赤泥-纳米粒子的磁分离被认为是去除抗生素的有效方法。

氧化镁-氧化锌(ZnO-MgO)纳米复合材料和MgO纳米颗粒具有成本低、易合成的特点,同样可用于去除抗生素[17]。因此,Zhang等[18]研究了氧化镁(ZnO)纳米颗粒和氧化锌(MgO)纳米复合材料对利奈唑胺的吸附。采用Box-Behnken设计(BBD)的RSM研究了吸附剂用量、pH值和温度对利奈唑胺吸附性能的影响。结果表明,使用无毒吸附剂,通过简单的程序可以在短时间内有效去除大量利奈唑胺(90%),表明ZnO-MgO纳米复合材料和 MgO 纳米颗粒的联合作用是一种灵敏、有效和高效的吸附剂。

生物炭和活性炭是具有高吸附力的碳质材料,被广泛应用于吸附污染物[19-20]。Kim等[21]评估了添加苹果树衍生生物炭(biochar derived from apple tree,AB)的活性污泥系统对CIP的去除性能,AB以10%、20%和40%的不同比例添加到活性污泥生物反应器中,CIP的减少和消除(高达94%)主要归因于AB的吸附,CIP去除率与AB的添加量有关。吸附动力学和等温分析表明吸附过程涉及粒子内扩散、π-π电子-供体-受体相互作用、疏水性相互作用和静电引力。马佳莹等[22]使用食物垃圾和鸡粪作为基质,研究了厌氧消化(anaerobic digestion,AD)过程中粉状活性炭(powdered activated carbon,PAC)产生甲烷和去除抗生素的机制,表明在厌氧共消化反应器中添加AC可以增加甲烷产量,同时去除各种抗生素,抗生素浓度的降低主要归因于PAC的物理吸附和细菌的灭活。

2.1.2 高级氧化法 在吸附剂中添加合适的降解酶可以提高抗生素去除效率。Sun等[23]用固定化漆酶修饰的中空介孔碳球(hollow mesoporous carbon sphere,HMCs)探索虫胶在降解过程中抗生素和氧化还原介质刺激作用下的降解机制。结果表明,二羟基化和去甲基化是盐酸四环素(tetracycline hydrochloride,TCH)的主要降解反应,哌嗪取代基氧化和羟基化是盐酸环丙沙星(ciprofloxacin hydrochloride,CPH)的主要降解反应。此外,添加3 mm磺胺类抗生素(sulfonamide antibiotics,SA)氧化还原介质后,固定化虫胶对TCH和CPH的去除效率分别为99.4%和96.9%。

Hou等[24]设计了一个由缺氧-好氧(anoxic-aerobic,A/O)池、上流式厌氧污泥床(upflow anaerobic sludge blanket,UASB)和4个独立的高级氧化工艺(advanced oxidation process,AOP)组成的实验室模拟反应器,从实际的制药废水中同时去除了18种抗生素和10种ARG。CAO等[25]系统地研究了零价铁(Fe0)过硫酸盐(peroxymonosulfate,PMS)对四环素的降解,结果表明,在最佳条件下,四环素在5 min内去除率达到88.5%。其反应机理表明四环素通过活性氧的氧化和少量吸附被去除。Xu等[26-27]制备了氧化石墨负载的CoFe2O4(CoFe2O4-EG)作为多相催化剂来活化PMS,进而催化磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole,SMX)的降解,SMX去除率在20 min内高达99%;又通过水热法成功构建了膨胀石墨固定镍铁氧体(NiCo2O4),并通过PMS活化法将其应用于模型废水中SMX的降解。它被证明具有高催化活性(99.9%)、高矿化率(32.4%)和低离子浸出率。

除了上述吸附法、高级氧化法以外,还有过滤法、絮凝法,以及基于一定条件的组合策略如溶胶-凝胶法、臭氧和光催化法、紫外线照射和光催化法等等[28]。

2.2 生物方法

2.2.1 高温堆肥法 如何有效去除畜禽粪便中的抗生素是近年来环境科学研究的热点。高温堆肥作为处理有机固体废物(如畜禽粪便污泥和城市生活垃圾)的有效方法,在国内外得到广泛研究和应用。最近关于从牲畜粪便堆肥中去除抗生素的研究主要集中在四环素,其他类型的研究较少。仅有Xia等[29]、Yang等[30]进行了从肉鸡粪便中去除氟喹诺酮类抗生素的堆肥试验,但抗生素浓度和堆肥时间对抗生素去除率的影响并不显著。Xie等[31]指出,堆肥过程包括复杂的微生物动力学,这取决于堆肥的材料和条件。因此,堆肥对减少粪便携带的ARGs的影响因不同的研究而异。为了确定堆肥设施的大气环境对ARGs丰度的影响,Cui等[32]进行了半透膜覆盖的高温堆肥和污泥的传统高温堆肥。与常规高温堆肥的结果相比,半透膜覆盖的高温堆肥处理后ARGs的总丰度下降了42.1%。周顺桂团队开发了UTM超高温好氧发酵技术,研究表明超高温堆肥发酵温度高,发酵速度快,且具有更高效、更迅速的ARGs去除效果[33]。本课题组的研究也发现,不同的粪便处理方法会引起ARGs的不同变化,但ARGs的总丰度会降低,且厌氧堆肥对ARGs的清除效果比厌氧消化更好[34]。

2.2.2 生物去除法 Bai等[35]进行了利用假单胞菌H117去除TC、硝酸盐、Mn(II)、生物锰氧化物(biological manganese oxide,BMO)和磁性BMO(magnetic biological manganese oxide,MBMO)的研究,结果表明,该菌株在96 h内对TC(68.86%)、硝酸盐(100%)和Mn(II)(64.64%)的去除率较高,而对BMO和MBMO的去除率分别为91.29%和96.63%。

3 小 结

抗生素抗性基因的进入会导致菌群结构的改变,并随菌群的演替富集在其生存环境中,随菌群的迁移而迁移。抗性基因作为一种新型的污染物,应从污染源头和传播两方面入手消除,即抗性基因宿主菌群和基因水平转移中发挥重要作用的可移动遗传元件。目前的方法不同程度地降低了污水、污泥、粪便中抗性基因丰度,但增加了污染治理的成本,研究人员应考虑从源头减少抗性基因的产生。在畜牧业养殖生产上,减少饲料中抗生素添加剂的使用,以降低抗生素对菌群的选择压力,降低抗性基因的水平转移。考虑能否开发能降低抗性基因产生并对畜禽无害的添加物,以达到从源头消减抗性基因污染的目的。未来的研究方向,一方面是开发抗生素替代物,减少抗生素的使用;另一方面是优化污水污泥处理工艺,最大程度地消除抗性基因污染。