欧亚葡萄品种“魏可”不同着色期果皮转录组差异分析

魏世平,李 静,解振强

(江苏农林职业技术学院/江苏现代园艺工程技术中心,江苏镇江,212400)

欧亚种或欧洲葡萄(Vitisvinifera)是中国主要栽培的葡萄种类。其中,“魏可”(Wink)品种具有树势强、果肉脆、汁多微甜且抗病性强等优势,为优良晚熟品种,被广泛栽培种植[1]。葡萄在成熟过程中没有明显的呼吸跃变期,但其浆果大小、硬度、色泽以及内部生理生化在转色期均发生剧烈变化。例如:表皮叶绿素降解、花青素累积、浆果软化、可溶性糖含量增加、有机酸含量下降等[2-3]。分子生物学技术的发展带来诸多基因层面的探索,并用在葡萄研究中得到广泛应用[4-7]。有研究者发现,山葡萄转色前、50%着色期以及完熟期之间均存在差异表达基因,COG注释表明这些差异表达基因涉及山葡萄生长发育过程中绝大部分生命活动,其中包含碳水化合物、氨基酸、次生代谢物等合成、运输和代谢[8]。也有研究者发现,葡萄转色期花青素合成的上游调节与光合作用代谢途径相关,且56个候选基因(30个结构基因和26个调控基因)被鉴定出可能参与欧亚葡萄“染色葡萄”品种(teinturier grape,花青素在果皮和果肉组织中积累的红肉品种,用于与其他葡萄品种混酿,为葡萄酒液带来更深的颜色)花青素的生物合成途径[9]。上述研究均基于RNA-Seq测序和生物信息学分析得到。目前,针对“魏可”葡萄转色期前后转录组水平变化的研究仍缺乏。笔者以“魏可”葡萄为研究对象,采集转色前后及完熟期果实,利用高通量测序技术进行分析,探讨“魏可”转色前后及完熟期之间差异表达基因的种类及变化规律,为后续转色相关功能基因的深入研究以及新品种的培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以欧亚种葡萄品种“魏可”(Vitisvinifera‘Wink’)为研究对象,栽培于江苏农林职业技术学院葡萄基地。2021年,在转色前、转色15 d后及完熟期分别采集新鲜饱满果实样品,经液氮速冻后置于-80 ℃保存。使用手术刀将果皮、果肉及种子分开,将果皮在液氮下研磨成粉状[10]。

1.2 方法

1.2.1 RNA样品提取和检测 果皮样品RNA提取以及转录组测序委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成[11]。对RNA样品,采用琼脂糖凝胶电泳检测其降解程度及污染情况,采用Nanodrop检测RNA纯度(OD260/280比值),采用Qubit精确定量RNA浓度,采用Agilent 2100精确检测RNA完整性。

1.2.2 cDNA 文库构建和库检 RNA样品经检测合格后,用含有Oligo(dT)的磁珠,运用A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断,以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成单链cDNA,再加入DNA polymerase I、dNTPs和缓冲液合成双链cDNA,随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA经末端修复、加A尾并连接测序接头后,再次利用AMPure XP beads进行片段大小选择,最后进行PCR富集,得到最终的cDNA文库[12]。

文库构建完成后,用Qubit 2.0进行初步定量,稀释文库至1 ng/uL,随后使用Agilent 2100对文库的插入片段长度进行检测,插入片段长度符合预期后,使用Q-PCR方法对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度设定为>2 nmol/L),以保证文库质量。

1.2.3 上机测序 对于库检合格的样品,将不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求合并(pooling)后进行Illumina HiSeqTM高通量测序。

1.2.4 数据质量评估 Illumina HiSeqTM高通量测序得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads),即Raw Data或Raw Reads。Raw Data经错误率分布检查和A/T/G/C含量分布检查后进行质控。质控步骤包含:1)去除带接头(adapter)的Reads;2)去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的reads;3)去除低质量Reads(Qphred≤ 20 的碱基数占整个Read 长度的 50%以上的 Reads)。

1.2.5 数据比对 选取HISAT软件将过滤后的测序序列比对参考基因组进行基因组定位分析。HISAT的算法主要分为3个部分:(1)将测序序列整段比对到基因组单外显子;(2)将测序序列分段比对到基因组的两个外显子上;(3)将测序序列分段比对到基因组3个及以上外显子。

1.2.6 生物信息学分析 样品间基因表达水平相关性,是通过计算两两间皮尔逊(Pearson)相关系数进行衡量。采用有生物学重复的DESeq标准化方法进行差异基因表达分析。差异基因筛选标准为padj<0.05,并用火山图进行展示。采用GOseq软件,基于Wallenius non-central hyper-geometric distribution方法进行基因本体(Gene Ontology,GO)注释分析[13]。经KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)比对,找出与整个基因组背景相比,在差异表达基因中显著性富集的通路(Pathway)[14]。采用iTAK 软件进行转录因子分析[15]。

2 结果与分析

2.1 测序质量及比对分析

Illumina测序的raw reads经质控后,得到转色期、转色后15 d和完熟期的Clean reads分别为24 912 603、24 979 749和24 833 203条;Q30均大于92.52%,Q20均大于96.97%;GC含量分别为46.80%,46.50%和46.33%。可见,测序质量较好。将测序结果与参考基因组进行比对,3个时期样品的比对效率分别为89.41%,89.42%和88.96%,且唯一比对位置百分比为86.80%、86.86%和86.32%(见表1)。3个时期均是比对到外显子(Exon)的reads含量最高,范围为95.4%～96.9%;比对到内含子(Intron)的reads含量范围为1.7%～3.1%;比对到基因间区(Intergenic)的reads含量均为1.5%(见图1)。

图1 “魏可”葡萄不同着色期果皮基因组不同区域reads分布

表1 “魏可”葡萄不同着色期果皮转录组测序质控及比对结果

2.2 基因表达水平和差异表达基因

样品间的Pearson相关系数均大于0.90,表示样本间重复性较好(见图2)。依据FPKM基因表达量的计算结果,得到存在不同时期间的显著差异表达的基因,转色后15 d与转色期相比的显著差异基因数为3 096个,其中,显著上调基因数为1 328个,显著下调的基因数为1 768个(见图3A);完熟期与转色期相比的显著差异表达基因数为4 444个,1 883个显著上调,2 561个显著下调(见图3B);完熟期与转色后15 d相比的显著差异表达基因数为1 156个,395个显著上调,761个显著下调(见图3C)。

注:T1代表转色期,T2代表转色后15 d,T3代表完熟期。T1_1、T1_2和T1_3分别为T1的3个生物学重复,T2和T3以此类推。

注:T1代表转色期,T2代表转色后15 d,T3代表完熟期,同图2。

2.3 GO富集

转色后15 d与转色期之间、完熟期与转色后15 d之间以及完熟期与转色期之间差异表达基因的GO注释和富集分析结果表明,差异表达基因在分子功能(Molecular Function)、生物过程(Biological Process)和细胞组成(Cellular Component)三个分类水平上差异较大(见表2至表4)。

表2 “魏可”葡萄转色后15 d与转色期相比果皮差异表达基因GO显著富集条目

与转色期相比,转色后15 d的差异表达基因从整体分析来看,在GO中显著富集的有7个,主要涉及木葡聚糖-木糖基转移酶活性功能、质外体细胞组分以及糖类和碳水化合物代谢过程。下调差异表达基因显著富集的有17个,主要涉及分子功能中木葡聚糖-木糖基转移酶活性、氧化还原酶活性、铁-硫簇结合,细胞组分中质外体、膜、类囊体等,生物过程中碳水化合物、类固醇、有机氮代谢过程(见表2)。

与转色期相比,完熟期差异表达基因从整体分析看显著富集的有11个,主要涉及分子功能中的核糖体结构成分及结构分子活性,细胞组分中的核糖核蛋白复合物、核糖体、脂质粒、脂质贮存体,生物过程中的有机物生物合成过程及细胞生物合成过程。下调差异表达基因显著富集的有27个,主要涉及分子功能中的核糖体结构成分及结构分子活性、辅酶结合、氧化还原酶活性,细胞组分中的核糖体、膜、非膜结合细胞器,生物过程中的碳水化合物、酰胺、有机氮化合物、肽、类固醇等的代谢和合成过程、以及氨基酸、阴离子、有机酸的跨膜转运。上调差异表达基因显著富集的有28个,主要涉及分子功能中的核酸、DNA结合,细胞组分中的核,生物过程中核酸和RNA的合成及代谢过程、以及有机环状化合物、芳香族化合物、氮化合物、大分子生物、含碱基化合物等的合成及代谢过程(见表3)。

表3 “魏可”葡萄完熟期与转色期相比果皮差异表达基因GO显著富集条目

与转色后15 d相比,完熟期整体分析和下调差异表达基因均未达到显著富集水平,上调差异表达基因显著富集有3个,分别为木葡聚糖-木糖基转移酶活性、质外体和细胞壁(见表4)。

表4 “魏可”葡萄完熟期与转色后15 d相比果皮差异表达基因GO显著富集条目

2.4 KEGG富集

差异表达基因在KEGG注释中达到显著富集水平的共计有10条代谢通路(见图4)。其中,与转色期相比,转色后15 d下调表达基因中显著富集3条代谢通路,分别为光合作用-触角蛋白(Photosynthesis-antenna proteins)、抗坏血酸和醛酸代谢(Ascorbate and aldarate metabolism)及光合生物的固碳作用(Carbon fixation in photosynthetic organisms)(见图4A)。与转色期相比,完熟期下调差异表达基因中显著富集4条代谢通路,分别为核糖体(Ribosome)、光合作用-触角蛋白、半乳糖代谢(Galactose metabolism)和光合作用(Photosynthesis)(见图4B);上调差异表达基因中显著富集2条,分别为剪接体(Spliceosome)和mRNA监测路径(mRNA surveillance pathway)(见图4C)。与转色后15 d相比,完熟期下调差异表达基因中显著富集1条代谢通路,即半乳糖代谢(见图4D)。

注:T1代表转色期,T2代表转色后15 d,T3代表完熟期,同图2。Up代表上调,Down代表下调。

2.5 差异基因转录因子分析

通过采用hmmscan搜索植物中的转录因子特征结构域的方法,对转录组数据进行转录因子编码基因的预测,结果得到共计62个转录因子基因家族的446个转录因子。其中,包含38个MYB,34个AP2-EREBP,27个C2H2,23个NAC,20个bZIP,20个HB,19个Orphans,17个C3H,16个bHLH,13个PHD,12个C2C2-Dof,12个GRAS,12个WRKY,11个MADS,11个SNF2,10个LOB等转录因子家族。

3 讨论与结论

从差异表达基因的GO富集分析结果来看,“魏可”葡萄完熟期果皮与转色期果皮相比在整体分析上的差异表达基因数以及上下调差异表达基因数均为最多,且涉及生长发育过程中多数生命活动。这在山葡萄不同着色时期果皮差异表达基因的COG注释中也得到类似结果[8]。分子功能类别中木葡聚糖-木糖基转移酶活性(GO:0016762)以及细胞组分中质外体(GO:0048046)基因,“魏可”葡萄转色后15 d果皮与转色期果皮相比为显著下调,完熟期果皮与转色后15 d果皮相比则为显著上调。木葡聚糖为长链多糖,可与纤维素的微纤丝形成氢键构成交联网络,进而影响细胞壁结构[16]。质外体由细胞壁、胞间隙和导管组成[17],故与木葡聚糖-木糖基转移酶活性变化规律一致。木葡聚糖-木糖基转移酶,即木葡聚糖内转糖苷酶,是细胞壁重组的关键酶[18-19],可催化木葡聚糖分子转移或水解,在植物生长过程中可参与细胞壁的降解和合成,与果实生长与成熟软化有密切的关联[20]。

从差异表达基因的KEGG富集分析结果来看,在“魏可”葡萄果实转色过程中,与光合作用相关途径下调。Wang等[9]利用转录组学分析欧亚葡萄“染色葡萄”品种(红肉品种)浆果发育及花青素生物合成时,得到光合作用-触角蛋白和光合作用在KEGG注释中显著富集,并由此推断光调节是红肉品种花青素生成的主要原因。果实中半乳糖是初生细胞壁的成分之一,其含量与果实软化程度有关。“魏可”葡萄完熟期果皮半乳糖代谢与转色期和转色15 d相比较均显著富集下调。这与欧亚葡萄品种“Shiraz”果实成熟期半乳糖含量会略有下降[21]的研究结果相匹配。

转录因子是一类响应植物生长发育和激素信号不可缺少的调控因子。本研究对不同着色期“魏可”葡萄果皮进行差异基因转录因子分析,检测到部分常规转录因子(如MYB和bHLH等)和新型转录因子(如NAC,bZIP、WRKY、MADs等)[22]。MYB转录因子是高等植物中一类重要的转录因子,R2R3-MYB在花青素合成过程中起重要作用[23-24]。转录因子MYB和bHLH之间存在组合调控现象,有研究证实bHLH转录因子和R2R3-MYB共同调节花色苷的合成[25]。编码NAC新型转录因子的基因VvNAC26,在葡萄中被鉴定出来,其与葡萄浆果早期发育有关,且参与葡萄果粒大小的决定过程[26]。转录因子bZIP、WRKY和MADs均是植物生长发育过程中较为重要的家族,在果实成熟、种子成熟、花形态建成和发育、抗逆响应等过程中发挥调节作用[27-29]。此外,本研究还鉴定出AP2-EREBP和C2H2转录家族的34个和27个转录因子,仅次于MYB家族。AP2-EREBP家族主要参与植物激素信号转导以及植物对病原体、各种环境胁迫(如低温、干旱、高盐等)分子应答反应[30-31]。C2H2转录因子是一类在真核生物基因组分布最为广泛的锌指蛋白,在植物生长发育(如葡萄花粉发育)及非生物胁迫响应等方面发挥重要作用,且参与脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)等激素信号传导、低温信号转导等途径[32-33]。对于鉴定出的转录因子其相关基因功能的挖掘还需更深入的研究确定。