抑制猪支持细胞外泌体对精原干细胞自我更新及分化的影响

田海瑞,汪晶晶,李晓晓,张丹琛,邹康

(南京农业大学干细胞研究与转化中心/动物科技学院生殖干细胞与微环境实验室,江苏 南京 210095)

猪因在解剖学和生理学与人类高度相似,如饮食、肥胖倾向、消化系统、泌尿系统和有氧运动的血液循环系统[1],经常被用作动物模型进行生理和药理学研究。因公猪连续产生大量配子的必要性,人们对精子发生提出了更高的要求:在整个生命周期,需要一个活跃的干细胞群,以高水平的组织协调来确保精子的持续供应。这个干细胞群为精原干细胞群(spermatogonial stem cells,SSC):通过自我更新维持自身细胞数目的平衡,以及分化产生不同等级的精原细胞、精母细胞和精细胞。一般认为分化程度最低的精原细胞即 Asingle(As)型精原细胞为SSC,在曲细精管的基底膜上以单个细胞的形式存在。SSC在转基因猪的生产和建立猪再生医学模型方面具有重要价值,然而由于其数量少及体外无法长期培养,导致猪精原干细胞(pSSC)的研究和应用受到了极大阻碍。pSSC在不同饲养层上培养,生长状态不同,大多研究将支持细胞作为饲养层细胞。在哺乳动物体内,支持细胞是SSC微环境的重要组成部分,在维持SSC自我更新和分化平衡及睾丸稳态方面发挥重要作用。支持细胞会产生胶质细胞源性神经营养因子(glia cell-derived neurotrophic factor,GDNF)和成纤维细胞因子2(fibroblast growth factor,FGF2),对维持SSC的存活和自我更新至关重要[2-3];此外,支持细胞产生的干细胞因子(stem cell factor,SCF)、维甲酸(retinoic acid,RA)、骨形态发生蛋白 4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)也可以诱导精原细胞分化。因此,支持细胞分泌的调控因子是影响精原干细胞命运的一种重要物质。

外泌体是直径为30～150 nm的细胞外囊泡,被脂质双分子层包裹各种生物分子,包括蛋白质、聚糖、脂质、代谢物以及核酸。随着对外泌体的深入研究,其在细胞间的通讯作用受到广泛关注,包括免疫应答、蛋白核酸转移[4]、衰老[5]、增殖分化[6]等。例如:外泌体携带的miRNA能够协调肿瘤代谢微环境,可作为肿瘤诊断的标记物,甚至外泌体“物质传递”的特性可以用于肿瘤治疗[7];癌细胞来源的外泌体可以将信息传递给基质成纤维细胞,促使其分化为肌成纤维细胞[8];前列腺癌细胞来源的外泌体在局部肿瘤微环境的细胞间通讯中发挥关键作用,可显著减少正常细胞凋亡、增加癌细胞增殖并诱导癌细胞迁移[9]。外泌体在雄性生殖系统也发挥生物学功能,前列腺体将膜成分以及遗传物质转移到精子,增加精子活力,同时避免过早获能和自发的顶体反应,保护精子免受女性生殖道的免疫反应[10]。附睾小体在精浆和精子间的通讯中发挥作用,能够改变精子膜的脂质组成,从而有助于精子获得运动潜力和穿透透明带的能力[11]。此外,外泌体成为治疗不孕症的新尝试,在受损精子和治疗弱精子症方面发挥作用。例如:无精症大鼠注射羊水来源外泌体后,精子发生改善,恢复精子参数(如,运动性、浓度以及精原细胞与精母细胞的数量),并最终恢复雄性生育能力[12];犬脂肪间充质干细胞来源外泌体对犬精子冷冻损伤以及对解冻后精子参数的改善发挥积极作用[13]。然而,有关外泌体在雄性生殖的研究更多侧重于生殖细胞发育、精子功能和附睾成熟,对SSC命运的调控关注甚少,尤其是外泌体是否能够调控猪精原干细胞命运这一问题亟待解答。

为了优化猪精原干细胞的体外培养条件,进一步探究影响精原干细胞命运的因素,了解支持细胞对精原干细胞调控的分子机制,本试验拟分离猪支持细胞并提取猪支持细胞外泌体,用外泌体抑制剂(GW4869)处理支持细胞,再与pSSC共培养,探究支持细胞外泌体对猪精原干细胞命运的影响因素,为优化猪精原干细胞体外培养方法及体内调控精子发生提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验所用的猪睾丸来自7日龄的雄性长白猪。由猪场实验人员采集睾丸组织,浸泡于含双抗的PBS中运输至实验室。所有动物试验和程序均经南京农业大学动物保护委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器

倒置显微镜购于OLYMPUS公司,超净工作台购于苏净安泰公司,高速冷冻离心机、CO2培养箱购于Thermo Fisher Scientific公司,超速离心机为贝克曼库尔特Optima系列;GW4869购于大连美仑生物技术有限公司,维生素、胎牛血清、胶原酶、非必需氨基酸、胎牛血清、F12/DMEM培养基、胰酶均购于Gibco公司,红细胞裂解液购于北京索莱宝科技有限公司,巯基乙醇、L-谷氨酰胺和FGF2、GDNF、GFRA1等生长因子购于Sigma公司,青霉素购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,TRNzol Universal试剂购于天根生化科技有限公司。

pSSC培养液:F12/DMEM培养基、10 g·L-1维生素、5×10-5mol·L-1巯基乙醇、10%胎牛血清、5 g·L-1青霉素、10 ng·mL-1FGF2、10 ng·mL-1GDNF、10 ng·mL-1GFRA1。

支持细胞培养液:F12/DMEM培养基、10%胎牛血清、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、0.5%青霉素、1%非必需氨基酸、5×10-5mol·L-1巯基乙醇。

1.3 猪精原干细胞和支持细胞的分离

在不破坏睾丸表面膜结构的情况下,将睾丸外周附睾、脂肪等组织剥离,去除表面白膜和中心白色结缔组织后用眼科剪将组织剪碎,加入胶原酶吹散后放入CO2培养箱中37 ℃消化。每隔10 min取出重新吹散,消化至无组织团块,总时间约30 min。加入红细胞裂解液,4 ℃处理15 min。离心后加入胰酶消化5 min,用10% FBS终止消化,离心,得到睾丸总细胞。

分离精原干细胞:将睾丸总细胞用支持细胞培养液重悬,分别在CO2培养箱中37 ℃培养15 min、30 min、2 h进行差异贴壁,离心,将培养液换成pSSC培养液后培养过夜。次日铺到丝裂霉素处理好的支持细胞上继续培养。

分离支持细胞:将睾丸总细胞用支持细胞培养液重悬,在CO2培养箱中37 ℃培养4 h后吸去上清液并去除未贴壁的杂细胞,换培养液过夜培养后进行低渗处理,得到纯化的支持细胞。

1.4 外泌体的提取

体外培养的支持细胞在培养密度接近60%～70%时,将支持细胞培养液更换为无血清培养液,培养 48 h 后收集细胞上清液,采用差速离心法提取外泌体。具体方法:300g离心10 min,去除细胞;2 000g离心10 min,去除死细胞;10 000g离心30 min,去除细胞碎片;120 000g离心90 min,得到沉淀即为外泌体,再用PBS重悬、漂洗,120 000g再离心90 min,得到外泌体沉淀。

1.5 支持细胞外泌体分泌的抑制

GW4869母液的配制:将5 mg GW4869加入158 μL二甲基亚砜(DMSO),配制成100 mmol·L-1GW4869母液,避光-80 ℃保存。

支持细胞外泌体的分泌抑制:用无血清培养液分别配制5、10、20、50和100 μmol·L-1GW4869。将支持细胞接种到60 mm或者100 mm培养皿中,放入CO2培养箱中37 ℃培养,当细胞密度大概铺满培养皿底部约60%时,去除培养液后用D-Hanks洗3次。分别加入5、10、20、50和100 μmol·L-1GW4869,CO2培养箱中37 ℃培养48 h。

比较2组患者治疗前治疗后3月及6月时肿瘤体积;比较2组患者治疗前、治疗后12月时的甲胎蛋白(AFP)水平，2组患者术后并发症、治疗后3月时的肿瘤完全坏死率及治疗后1、2及3年生存率。肿瘤体积以CT测量为准，V=πabc/6 cm3(V为体积，a、b、c 为肿瘤的长、宽、高)，于治疗前、治疗后12月时，采集患者空腹静脉血，分离血清，采用电化学发光法测定AFP水平。

1.6 RNA 提取、cDNA合成和逆转录 PCR(RT-PCR)

采用 Trizol法提取睾丸组织及细胞样品总RNA。采用RNA反转录试剂盒(Vazyme)合成 cDNA。参照试剂盒说明进行RT-PCR反应,以GAPDH为内参,用ddH2O作阴性对照。本试验所用引物序列见表1。

表1 试验所用引物序列Table 1 The primer sequences used in the experiment

1.7 睾丸组织、外泌体和细胞蛋白的提取及Western Blot 分析

将睾丸组织、细胞或外泌体加入配制好的 Ripa 裂解液(含 5 g·L-1的 PMSF 和 DTT),置于摇床上,冰浴裂解15 min。用无菌1.5 mL EP管收集样品并加入蛋白变性缓冲液进行蛋白变性。取出配制好的蛋白免疫印迹凝胶,上样后80 V 电泳20 min后调整电压为120 V,根据试验所需进行电泳时间的控制。电泳结束后根据试验需要切胶,裁剪适当大小的PVDF膜和滤纸,按照负极-纤维垫-滤纸-胶-膜-滤纸-纤维垫-正极的组装方式组装,然后进行转膜。转膜结束后将PVDF膜用TBST 洗涤1 min,转入5%脱脂奶粉,室温封闭1～2 h。加一抗(根据试验需要选择稀释比例)孵育,4 ℃冰箱过夜。TBST洗膜3次后加二抗(1∶5 000 稀释)并室温孵育1 h,TBST 洗膜3次,暗室中加入 ECL 显示免疫条带,用胶片按压曝光条带。抗体信息见表2。

表2 所用抗体信息Table 2 Detail of antibodies

1.8 免疫荧光检测支持细胞、pSSC及外泌体

将支持细胞或pSSC铺到96孔板,在CO2培养箱中37 ℃培养,免疫荧光检测时将培养液去除,用PBS清洗2～3次。用卡诺固定液-20 ℃固定20 min;免疫荧光检测外泌体存在时用4%中性福尔马林对支持细胞进行固定,室温条件放置15 min;去除固定液,用PBS洗2～3次。用10% 的山羊血清37 ℃封闭 30 min;一抗(支持细胞特异性标记物WT1和ITGB1,SSC特异性标记物PLZF和DDX4,外泌体特异性标记物HSP70)用含1%山羊血清的PBS按1∶200进行配制,随后用其孵育细胞,并将96孔板放入湿盒中,4 ℃冰箱中过夜。PBS洗3 次后避光加入二抗(用含1%山羊血清的PBS按1∶500进行配制)37 ℃孵育 60 min;PBS洗3次后避光加入hoechst33342(1∶500),37 ℃孵育15 min,PBS洗3次后加入抗淬灭剂,置于湿盒中,使用荧光显微镜观察并拍照。

1.9 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 猪支持细胞的分离与鉴定

如图1-A所示,7日龄仔猪睾丸经过两步酶消化以及低渗纯化处理后得到支持细胞。低渗处理时,细胞并未完全伸展开,呈现不规则状,再培养1 d后,细胞完全伸展,形态多为规则的梭形。

图1 猪支持细胞的分离纯化培养以及鉴定Fig.1 Isolation,purification,culture and identification of porcine Sertoli cells(SC)A.支持细胞分离纯化与培养Isolation,purification and culture of Sertoli cells(SC);B. 免疫荧光检测支持细胞特异性标记物WT1、ITGB1(100×)Immunofluorescence detection of Sertoli cells markers WT1,ITGB1(100×);C. 细胞WT1和ITGB1阳性率统计Analysis of the positive rate of WT1 and ITGB1,respectively;D.RT-PCR检测支持细胞特异性标记物WT1、AR、ITGB1、SOX9 RT-PCR detection of Sertoli cells markers WT1,AR,ITGB1,SOX9.

通过IF对分离得到的支持细胞进行了纯度分析,如图1-B。用支持细胞特异性标记物WT1和ITGB1进行标记,WT1阳性细胞率达到(87.1±0.02)%,ITGB1阳性细胞率达到(94.2±0.01)%(图1-C);同时,RT-PCR结果显示分离的细胞表达支持细胞特异性标记物WT1、AR、ITBG1、SOX9基因(图1-D)。以上结果表明高效分离并纯化了猪的支持细胞。

2.2 猪支持细胞外泌体的鉴定

研究表明,如果细胞具有质膜的离散区域,这些区域富含外泌体和内体蛋白,可以作为外泌体生物发生位点[14],这个位点可以通过免疫荧光检测。因此,我们将分离得到的支持细胞经过中性福尔马林固定,不进行透膜处理,用外泌体标记蛋白TSG101标记。结果发现支持细胞膜表面有明显的 TSG101信号堆积(图2-A)。

图2 猪支持细胞外泌体免疫荧光(A)和Western blot(B)检测结果Fig.2 Immunofluorescence(A)and Western blot(B)detection of exosomes secreted by porcine Sertoli cells(SC)黄色箭头标识TSG101阳性信号。Yellow arrows identify positive signals for TSG101.

为进一步验证支持细胞分泌外泌体,利用Western blot技术检测到了外泌体标记蛋白TSG101、ALIX、HSP70的表达(图2-B)。以上结果均证明猪支持细胞分泌外泌体。

2.3 精原干细胞的分离与鉴定

如图3-A所示,pSSC在培养前期以单细胞为主,细胞边界明显,呈规则的圆形。在培养5～6 d后,pSSC会形成葡萄状的细胞克隆,但单个细胞仍保持清晰的边界,且为规则的圆形。如图3-B所示,免疫荧光检测发现,pSSC表达猪精原干细胞特异性蛋白DDX4和PLZF。统计显示PLZF阳性细胞率为(80.6±0.02)%(图3-C)。另外RT-PCR结果也表明pSSC有表达猪精原干细胞特异性标记物THY1、PLZF、DDX4、KIT基因mRNA(图3-D)。以上均证明分离得到的细胞为纯度较高的猪精原干细胞。

2.4 GW4869抑制支持细胞外泌体分泌

GW4869是膜中性鞘磷脂酶(N-SMase2)的非竞争性抑制剂,可保护细胞免受神经酰胺积累介导的凋亡。由于N-SMase2对外泌体的分泌至关重要,GW4869可作为外泌体的抑制剂。为确定GW4869合适浓度,防止GW4869浓度过大导致细胞死亡而影响外泌体的分泌,根据之前报道[15-17],本试验分别选用了5、10、20、50和100 μmol·L-1GW4869处理猪支持细胞,结果如图4-A所示。5、10、20 μmol·L-1GW4869处理细胞后,细胞并没有发生明显变化,但50和100 μmol·L-1GW4869处理细胞后,细胞表面出现很多点状斑点,细胞状态出现明显损伤现象,且细胞死亡量增多,最终选择了20 μmol·L-1GW4869。

另外,为检测20 μmol·L-1GW4869对猪支持细胞外泌体的抑制情况,将20 μmol·L-1GW4869处理的支持细胞作为试验组,无处理的支持细胞为对照组,处理48 h后提取外泌体,通过Western blot检测分析 2组细胞外泌体的分泌情况,结果如图4-B所示。与对照组相比,试验组的外泌体TSG101、HSP70、ALIX表达量均下降。以上结果表明20 μmol·L-1GW4869可以有效抑制支持细胞外泌体的分泌。

2.5 支持细胞外泌体影响pSSC自我更新及分化

用20 μmol·L-1GW4869处理支持细胞48 h,去除 GW4869后作为饲养层与pSSC进行共培养。如图5-A 所示:与对照组相比,处理组的pSSC在共培养1 d时部分细胞呈现不透亮状态;共培养3 d后试验组pSSC状态变差,大多细胞呈现不透亮状态,且较对照组不贴壁的细胞克隆变多。收集共培养3 d的细胞,提取RNA,通过RT-PCR检测pSSC的标志基因表达变化。结果发现,pSSC中PLZF基因表达显著升高;KIT、THY1、DDX4基因表达水平显著降低(图5-B、C)。此外,收集细胞蛋白,利用Western blot技术检测了猪精原干细胞PGP9.5和DDX4蛋白表达水平。结果发现,在处理组支持细胞上共培养的pSSC,PGP9.5蛋白表达水平显著升高,DDX4蛋白表达显著下降,与RT-PCR结果一致(图5-D、E)。上述结果表明,体外培养抑制支持细胞外泌体的分泌,pSSC分化能力受到抑制,细胞趋向自我更新方向发展,支持细胞分泌的外泌体倾向于促进pSSC的分化。

图5 利用支持细胞-pSSC共培养模型检测外泌体对pSSC的影响Fig.5 Detection of the function of exosomes on pSSC using Sertoli cells-pSSC co-culture modelA. pSSC与支持细胞共培养(黄色箭头标识不贴壁的细胞)pSSC co-culture with Sertoli cells(yellow arrows identify non-adherent cells);B、C. RT-PCR检测pSSC标志基因的表达RT-PCR detection of the expression of pSSC marker gene;D、E. Western blot检测pSSC标志蛋白的表达Western blot detection of the expression of pSSC marker protein. *P<0.05,**P<0.01.

3 讨论

与啮齿动物相比,对畜禽的精原干细胞研究较少,未分化的猪精原细胞或pSSC的特异性标记物尚不明确。目前关于啮齿动物精原细胞不同阶段的分子标志物研究较为清晰,如:PLZF蛋白在 Asingle(As)、Apaired(Apr)和 Aaligned(Aal)精原细胞中表达,缺乏PLZF的小鼠精原细胞会随着年龄增长逐渐丧失,但不会有明显分化缺陷或支持细胞的丧失[18];KIT蛋白在 As、Apr和早期 Aal精原细胞中表达量较低或者并不表达,而在Aal和进一步分化的精原细胞中表达较强[19];THY1蛋白已被确定为啮齿动物和非人灵长类动物中的保守精原干细胞标志物,几乎所有THY1+细胞都是PLZF+和KIT-[20]。pSSC的一些特定生物标志物已被鉴定,例如PGP9.5、PLZF、同源结构蛋白(nanog homeobox,NANOG)和阶段特异性胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen 1,SSEA1)。DDX4是包括猪[21]在内的多个物种生殖细胞的特异性蛋白标志物,被广泛用于生殖细胞的鉴定。本试验RT-PCR检测结果证明当猪支持细胞外泌体受到抑制时,pSSC表现为THY1、KIT表达水平降低,PLZF表达水平升高;Western blot检测结果显示PGP9.5蛋白表达水平升高,表明支持细胞外泌体受到抑制时,pSSC状态发生变化,其分化能力受到抑制,细胞向自我更新方向发展。抑制猪支持细胞的外泌体分泌导致pSSC的状态变差,部分细胞呈现不透亮状态,并伴随DDX4基因的表达水平降低。这一现象可能是GW4869破坏了外泌体对pSSC分化状态的调控作用造成的,即已启动分化的精原细胞在外泌体被抑制后无法继续分化,导致这些细胞失去了自我更新的能力,因此发生了凋亡,但这还需更多的试验验证。另外,是否可以利用支持细胞外泌体优化pSSC体外培养条件以实现pSSC的长期培养,值得进一步探究。

我们推测外泌体受到抑制引起pSSC变化与猪支持细胞有关。猪支持细胞和鼠支持细胞一样也可以产生一些可溶性因子,在出生前维持性原细胞和出生后调控精原干细胞命运至关重要。如支持细胞会分泌胶质细胞源性神经营养因子(glia cell-derived neurotrophic factor,GDNF),过度表达 GDNF 小鼠会导致未分化精原细胞的积累,即GDNF 有助于精原细胞自我更新和分化的旁分泌调节[22]。此外,有研究表明pSSC体外培养需要 GDNF 以外的外在因素来促进增殖[23],如在新生大鼠睾丸细胞的培养液中加入纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)对生殖细胞增殖具有积极作用。对在体外培养pSSC的研究中发现,在pSSC培养液中加入表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)对 pSSC细胞克隆的形成有很大影响。在EGF存在的情况下,细胞克隆数量和覆盖总面积增加[24]。由于目前对支持细胞外泌体成分以及外泌体如何影响pSSC命运尚未可知,因此需要进一步对其进行成分分析,确定其中发挥生物功能的成分并进一步探究其分子机制。

外泌体在调节正常生命活动和疾病诊断治疗方面具有独特的生物学功能。首先体外注射外泌体抑制剂有利于疾病的治疗,例如腹腔注射GW4869减少了小鼠败血症引起的心脏炎症[25],GW4869通过阻止外泌体分泌可以减少体内淀粉样蛋白斑块的形成,这有利于阿尔茨海默病的治疗[26]。此外,通过外泌体靶向药物递送系统也有助于疾病的治疗,例如通过基因工程改造的外泌体可用于治疗乳腺癌[27],通过siRNA电穿孔改造的外泌体可用于治疗胰腺癌[28]。本试验结果显示猪支持细胞影响pSSC自我更新及分化,这为改善种公猪生殖力研究提供了新思路,未来可以利用GW4869或外泌体靶向注射,维持pSSC自我更新及分化,保证精子发生的有序进行,这对治疗公猪无精症、提高种公猪生殖力以及延长种公猪繁殖周期有重要作用。

综上,猪支持细胞分泌外泌体且受20 μmol·L-1GW4869的抑制,pSSC分化能力也受到抑制,细胞趋向自我更新方向发展;暗示外泌体是支持细胞调控精原干细胞状态的一种重要方式。本试验结果为进一步探索猪支持细胞对精原干细胞的调控机制提供了新思路,为改善种公猪繁育力提供了新方式,也为治疗雄性动物以及人类生殖疾病提供重要参考。