育雏温度对雏鸡卵黄囊脂肪酸吸收和肠道发育及代谢相关基因GLUT2和PepT1表达的影响

赵羽彤,陈兴勇,刘政权,常鹏辉,彭锦州,吉倩昀

(安徽农业大学动物科技学院/地方畜禽遗传资源保护与生物育种安徽省级实验室,安徽 合肥 230036)

雏鸡出壳后在营养上经历了由完全依靠内源性养分(卵黄囊)到依赖外源性饲料养分的转折,并将未吸收的卵黄囊从蛋腔中转入腹腔中作为暂时的营养来源[1]。良好的卵黄囊吸收效果可维持其早期生命力和后期生长发育[2]。卵黄免疫球蛋白IgY,又称卵黄抗体,能有效地填补雏禽自身建立免疫机能的空档期,刺激雏鸡肠道生长发育及免疫机能的建立[3]。卵黄囊中IgY随其他营养物质一起进入雏鸡体内,至 7日龄左右卵黄抗体(IgY)由雏鸡自身产生的抗体IgA取代,雏鸡逐渐建立自身免疫力[4]。因此,卵黄囊吸收效果直接影响雏鸡免疫水平。

常规育雏初始温度为32～35 ℃,以后每周降低2～3 ℃,至5～6周龄时温度降至20 ℃左右[5]。在出雏初期,雏鸡自身产生的热量并不能根据环境温度变化调节,因此,环境温度对雏鸡早期生长至关重要[6]。初生雏鸡需经历一系列后处理,包括性别鉴定、免疫注射和运输,最终进入育雏舍内,并被提供其良好的环境温度。因此,初生早期,环境温度不高会影响雏鸡卵黄吸收和肠道健康[7]。研究表明,雏鸡运输过程的低温环境是导致其7日龄死亡率增加的关键因素之一,且第1周20 ℃育雏温度导致雏鸡体重显著降低[8]。初生雏鸡卵黄囊吸收依靠一定的育雏温度,早期较低的育雏温度是否通过降低卵黄囊吸收进而导致雏鸡健康下降尚不得知。

卵黄囊在肠道的吸收效果直接决定肠道发育健康。肠道是家禽最重要的消化器官,主要负责食物的消化和氨基酸、碳水化合物等营养物质的吸收,对提高机体饲料效率有重要意义[9]。家禽通过肠黏膜吸收的营养物质主要为糖类、脂肪和蛋白质,而单糖直接吸收是鸡获得糖类的主要途径[2]。GLUT2属于GLUT家族,在肠上皮细胞的基底外侧膜上能够将单糖运输出细胞进入血液,满足孵化后早期生长对营养物质的需求[10]。此外,GLUT2在葡萄糖重吸收过程中也起到重要作用[11]。蛋白质分子质量大,机体不能直接分解吸收,需要被分解为小肽以供机体吸收,PepT1是质子偶联寡肽转运蛋白家族的成员之一,膳食氨基酸可以通过肽转运蛋白Pept1的作用作为二肽和三肽运输到肠上皮细胞中[12]。肠道对营养物质的吸收可通过肠绒毛长度、隐窝深度和绒隐比来反映,较长的绒毛长度和较小的隐窝深度说明肠道上皮细胞成熟度高,消化酶的合成和分泌加快,肠道消化功能增强[13]。

为了探究初生雏鸡早期较低的育雏温度是否影响卵黄吸收及肠道发育,本试验以世界公约组织收录的淮南麻黄鸡为对象,比较早期不同育雏温度对卵黄囊吸收、免疫球蛋白水平、肠道发育以及消化相关基因表达水平的影响,为初生雏鸡后处理环境温度提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料与样本采集

选取1日龄淮南麻黄鸡雏鸡189只(淮南市兴杨食品有限公司),随机均分为3组,育雏温度分别为33、30和27 ℃,每组3个重复,每个重复21只,2.5 d后统一育雏温度为33 ℃。饲料营养水平按照美国国家研究委员会(NRC)[14]标准进行,粗蛋白20%、粗纤维2.6%、钙1%、磷(可利用磷)0.45%、钠0.18%、赖氨酸1.08%、蛋氨酸0.45%、含硫氨酸(蛋氨酸+胱氨酸)0.77%、苏氨酸0.65%,以上均为质量分数。

育雏期内分别于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、7.0和14.0日龄从每个重复中取3只雏鸡,记录屠宰前活重;心脏采血,分离血清,用于抗体分析;屠宰记录法氏囊、脾脏和卵黄囊重;收集卵黄囊液于-20 ℃保存,用于脂肪酸组成和含量分析,只取前2.5 d卵黄囊样品用于分析;取小肠各段的中间部位,4%多聚甲醛固定,用于肠道结构分析;取小肠各段中间部位,-80 ℃保存,用于RNA提取。

1.2 脂肪酸测定

卵黄囊脂肪酸测定参照文献[15]的方法并进行适当修改。将0.6 g卵黄囊中卵黄组织转移至10 mL离心管,加入0.66 mL C11∶0内标(5 mg·mL-1)、0.66 mL 95%乙醇和1.33 mL纯水,于全自动样品快速研磨仪中55 Hz研磨3 min。转移混合物至含33 mg焦性没食子酸、33 mg沸石和3.3 mL盐酸(8.3 mol·L-1)烧瓶中。75 ℃水浴孵育40 min,加入3 mL 95%乙醇、10 mL乙醚和石油醚同体积混合物。振摇5 min后转移至分液漏斗中静置5 min,收集醚层提取液。重复上述步骤3次,将提取液转移至旋转蒸发仪浓缩至干,残留物即为脂肪提取物。加入1.6 mL 2% NaOH-甲醇溶液,80 ℃水浴孵化3 min。加入1.4 mL 150 g·L-1三氟化硼甲醇溶液,继续80 ℃水浴孵化3 min。待烧瓶冷却至室温后加入2 mL正庚烷,振荡5 min,再加入3 mL饱和氯化钠水溶液,静置5 min。吸取上层正庚烷提取液1.5 mL至含有0.6 g无水硫酸钠的离心管中,振荡1 min并静置5 min后吸取1 mL上清液,经0.22 μm有机相滤器过滤后至进样瓶中待测定。样品用安捷伦7890A气相色谱仪(安捷伦科技有限公司)进行分析,色谱柱为DEGS毛细管柱(DB-WAX,30 m×0.25 mm×0.25 mm)。柱温箱参数:初始柱温60 ℃,保持2 min后以15 ℃·min-1升高至200 ℃,然后以3 ℃·min-1升高至230 ℃,保持19 min。载气为高纯氮气,流速为0.8 mL·min-1。进样口和检测器温度240 ℃,进样体积1 μL,分流比10∶1。使用37种脂肪酸甲酯标准品(CDAA-252795,上海安谱实验科技有限公司)定性脂肪酸。使用C11为内标,通过公式计算各脂肪酸含量,同时计算饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)和总脂肪酸(TFA)含量。

1.3 免疫器官指数计算及免疫球蛋白检测

屠宰后分离免疫器官,称重,计算器官指数。计算公式:器官指数=器官重/活体重。

使用免疫球蛋白试剂盒(SU-B60107、SU-B60110、SU-B60340、SU-B60105,泉州市睿信生物科技有限公司),采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgY、IgA的含量。

1.4 肠道切片的HE染色

肠道组织固定后,经脱蜡、浸水、染核、分色、蓝化、染质、脱水、透明、封片,迅速滴加适量中性树胶(国药集团),加盖玻片后封片,用光学显微镜(IX73,Olympus)观察并拍摄小肠绒毛结构照片,每张切片随机取6个测量绒毛长度及隐窝深度并记录数据。

1.5 总RNA提取和cDNA合成

小肠各段组织RNA提取:使用Trizol法提取RNA,弃上清液,留下 RNA 沉淀,向离心管中加入 1 mL 75%乙醇(江苏强盛功能化学股份有限公司),4 ℃、12 000 r·min-1离心 5 min。取沉淀,开盖干燥 5～10 min。待干燥后加入 30～50 μL DEPC水(D2917391,上海翊圣生物科技有限公司)吹打溶解沉淀,放入-80 ℃冰箱中保存。小肠组织RNA的反转录步骤根据反转录试剂盒(11123ES10,上海翊圣生物科技有限公司)进行操作。

1.6 实时定量PCR(qPCR)分析

基因序列查自NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov),根据所需的鸡基因序列,使用 Primer 5.0软件设计引物,内参为鸡GAPDH基因。所有引物由通用生物系统有限公司(安徽)合成。引物序列见表1。小肠十二指肠、空肠、回肠组织的qPCR(25 μL)体系:12.5 μL Trans StartTMTop Green qPCR Supermix(北京全式金生物技术有限公司),上、下游引物各0.5 μL和2 μL cDNA,9.5 μL ddH2O。qPCR步骤:95 ℃ 5 min,40个循环(95 ℃ 10 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s),72 ℃延伸5 min,每个样品重复3次。采用2-ΔΔCT法处理数据。

1.7 数据统计分析

数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析,并采用邓肯氏多重比较法进行0.05水平上的差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 各温度组间淮南麻黄鸡雏鸡体重及卵黄囊重的比较分析

如表2所示:育雏2 d内,各温度组间雏鸡体重无显著差异(P>0.05)。育雏2.5 d后,30 ℃组雏鸡体重显著高于27 ℃组(P<0.05);育雏7 d,30 ℃和33 ℃组雏鸡体重显著高于27 ℃组(P<0.05);育雏14 d,30 ℃组雏鸡体重显著高于33 ℃和27 ℃组(P<0.05)。育雏1.5 d,雏鸡卵黄囊重在30 ℃组显著高于33 ℃组(P<0.05),其他育雏时间各组间卵黄囊重无显著差异(P>0.05)。

表2 育雏温度对雏鸡体重及卵黄囊重的影响Table 2 Effect of temperature on body and yolk sac weight of chicks

2.2 各育雏温度组间卵黄囊脂肪酸组成和含量的比较分析

雏鸡卵黄囊主要由15种脂肪酸组成(图1),主要包括C16∶0、C18∶1n9t、C18∶0、C18∶2n6t,分别占总脂肪酸含量的34.61%、24.37%、16.1%、13.65%,其次是C22∶0、C20∶4n6、C18∶1n9c、C20∶5n3、C16∶1,其含量占总脂肪酸含量的5.3%、1.14%、1.07%、0.56%、0.51%。雏鸡卵黄囊内脂肪酸含量在各育雏温度组间无显著差异(P>0.05,表3)。

图1 卵黄囊样品的GC-MS总离子图Fig.1 Total ion diagram of yolk sac sample by GC-MSC11∶0为脂肪酸含量测定内标。C11∶0 is the internal standard for determination of fatty acid content.

表3 育雏温度对总脂肪酸含量的影响Table 3 The effect of brooding temperature on total fatty acid content

2.3 各育雏温度组间雏鸡免疫器官和免疫球蛋白水平的比较分析

2.3.1 雏鸡免疫器官指数分析如表4所示,育雏7日龄,30 ℃组脾脏重显著高于其他2组(P<0.05),27与33 ℃组间无显著差异。育雏期间雏鸡免疫指数在各温度组间无显著差异(P>0.05)。

表4 育雏温度对免疫器官重及免疫器官指数的影响Table 4 Effect of brooding temperature on immune organs weight and immune organ index

2.3.2 雏鸡免疫球蛋白含量分析如图2所示,育雏期间3个温度组雏鸡血清中IgA含量和IgG含量无显著差异。育雏7 d,30 ℃组IgM含量显著高于其他2组(P<0.05)。在育雏2 d,30 ℃组IgY含量显著高于其他2组(P<0.05),育雏7 d,30 ℃组IgY含量显著高于27 ℃组(P<0.05)。

图2 育雏温度对孵化后各日龄鸡血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM、IgY)含量的影响Fig.2 Effects of brooding temperature on the content of serum immunoglobulin(IgA,IgG,IgY and IgM)in chicks同一时间点的不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。In the same time different letters mean significant difference(P<0.05).The same as follows.

2.4 不同育雏温度对小肠形态的影响

2.4.1 十二指肠形态测量如图3、图4所示,育雏2.5 d,30 ℃组肠绒毛长度显著高于27 ℃组(P<0.05)。育雏1 d,30 ℃组肠隐窝深度显著高于33 ℃组(P<0.05),育雏2 d和2.5 d时,30 ℃组肠隐窝深度显著高于27 ℃组(P<0.05)。育雏1 d,33 ℃组肠绒隐比显著高于其他2组(P<0.05),育雏14 d,30 ℃组和27 ℃组肠绒隐比显著高于33 ℃组(P<0.05)。

图3 雏鸡小肠各段的HE染色形态图Fig.3 HE staining morphology of various segments of the small intestine in chicks

图4 育雏温度对十二指肠绒毛长度和隐窝深度的影响Fig.4 Effects of brooding temperature on villi length and crypt depth in duodenum

2.4.2 空肠形态测量如图3、图5所示:育雏7 d,27 ℃组肠绒毛长度显著高于其他2组(P<0.05);育雏 14 d,30 ℃、27 ℃组肠绒毛长度显著高于33 ℃组(P<0.05)。育雏1 d和1.5 d,30 ℃组肠隐窝深度显著高于33 ℃组(P<0.05);育雏14 d,30 ℃组肠隐窝深度显著低于其他2组(P<0.05)。育雏0.5 d,33 ℃组肠绒隐比显著高于其他2组(P<0.05);育雏1.5 d,30 ℃组肠绒隐比显著低于其他2组(P<0.05);育雏7 d,27 ℃组肠绒隐比显著高于其他2组(P<0.05);育雏14 d,30 ℃组肠绒隐比显著高于其他2组(P<0.05)。

图5 育雏温度对空肠绒毛长度和隐窝深度的影响Fig.5 Effects of brooding temperature on villus length and crypt depth of jejunum

2.4.3 回肠形态测量如图3、图6所示:育雏1.5 d,30、27 ℃组肠绒毛长度显著高于33 ℃组(P<0.05);育雏2.5 d,33 ℃组肠绒毛长度显著高于27 ℃组(P<0.05);育雏14 d,27 ℃组肠绒毛长度显著高于其他 2组(P<0.05)。育雏2 d,30 ℃组肠隐窝深度显著高于其他 2组(P<0.05);育雏14 d,30、27 ℃组肠隐窝深度显著高于33 ℃组(P<0.05)。育雏2 d,30 ℃组肠绒隐比显著低于其他2组(P<0.05);育雏2.5 d,33 ℃组肠绒隐比显著高于其他2组(P<0.05);育雏14 d,27 ℃组肠绒隐比显著低于其他2组(P<0.05)。

图6 育雏温度对回肠绒毛长度和隐窝深度的影响Fig.6 Effects of brooding temperature on villus length and crypt depth of ileum

2.5 育雏温度对相关基因相对表达量的影响

如图7所示,十二指肠中GLUT2表达量在各个时间段无显著差异(P>0.05)。育雏1.5 d,27 ℃组空肠GLUT2表达量显著高于其他2组(P<0.05);育雏7 d,33 ℃组显著高于27 ℃组(P<0.05)。在回肠中,育雏1 d,33和30 ℃组GLUT2表达量显著高于27 ℃组;育雏2 d,30 ℃组显著高于27 ℃组;育雏7 d,30 ℃组显著高于 27 ℃组;育雏14 d,30 ℃组显著高于其他2组。育雏1、2 d,33 ℃组PepT1表达量显著高于其他2组(P<0.05);育雏14 d,30和27 ℃组PepT1表达量显著高于33 ℃组(P<0.05)。育雏1.5 d,27 ℃组空肠PepT1表达量显著高于其他2组(P<0.05)。育雏1和2 d时,30 ℃组回肠PepT1表达量显著高于其他2组(P<0.05);育雏14 d,30和27 ℃组均显著高于33 ℃组(P<0.05)。

图7 不同育雏温度下营养吸收相关基因在小肠中的表达量Fig.7 Expression levels of genes related to nutrient uptake in small intestine at different brooding temperatures

3 讨论

出雏初期,雏鸡自身体温调节机能不完善,需要外界环境温度维持自身代谢需要。因此,环境温度在育雏早期发挥重要作用[6]。本研究中,33 ℃组卵黄囊吸收效果良好,说明早期1～3日龄高温育雏有助于卵黄吸收。30 ℃组体重高于27 ℃和33 ℃组,可见,适宜的环境温度有助于刺激雏鸡采食。低温环境下饲养蛋雏鸭,雏鸭的维持需要代谢能均有随环境温度降低而升高的趋势[16]。低温时维持需要代谢能增加,刺激采食量,却无法弥补能量及营养源的不足。本研究中,27 ℃组体重低于30 ℃组,可能因为过低的温度使雏鸡维持需要代谢能增加,雏鸡需要增加采食量并消耗能量以维持机体代谢需要。

Sahan等[17]检测出52周龄和36周龄母鸡所产鲜蛋黄中脂肪酸主要为C16∶0、C18∶1n9t、C18∶0、C18∶2n6t。本研究中卵黄囊中所含主要脂肪酸种类与其一致,且C16∶0、C18∶1n9t、C18∶0、C18∶2n6t分别占总脂肪酸含量的34.61%、24.37%、16.1%、13.65%。3个育雏温度处理下,雏鸡卵黄囊中各脂肪酸含量均无显著影响,仅卵黄囊重出现显著差异,说明雏鸡生长发育过程对卵黄囊各组分的营养需求相对一致。

除遗传因素外,环境是影响免疫系统发育的关键因素,特别是在发育早期[18]。免疫器官的发育情况和功能状态可直接决定鸟类的免疫水平[19]。家禽体内淋巴管和淋巴结发育不全,因此在雏鸡的生长发育过程中,脾脏是重要的免疫器官之一。法氏囊是鸟类独有的体液免疫器官,在B淋巴细胞分化中起重要作用[20]。本研究主要探究育雏前60 h不同温度对后期脾脏及法氏囊发育的影响,发现7日龄时30 ℃组雏鸡脾脏重显著高于其他2组,说明高温育雏不能促进免疫器官发育,适宜的育雏温度有助于免疫器官发育。

免疫球蛋白可以通过抗原诱导转化为抗体,作为体液免疫的第一道屏障,在维持动物免疫功能方面起着重要作用[21]。Hamal等[22]检测了母鸡血清、卵黄、蛋清及雏鸡血清中的免疫球蛋白含量,发现免疫球蛋白IgY是母体抗体转移到雏鸡血液循环中的直接指标,预期转移比例约为30%。本研究中,30 ℃组雏鸡免疫球蛋白IgY含量显著高于其他2个温度组,因此推测30 ℃组对雏鸡卵黄囊中卵黄抗体吸收较好,能获得更高的免疫水平。

家禽小肠绒毛高度和隐窝深度是评价小肠消化吸收功能的重要指标。小肠绒毛高度越高,与食糜接触的表面积越大,表明肠道的吸收功能越强[23]。隐窝深度则是反映肠上皮细胞增殖率和成熟度的重要指标[24]。Zhang等[25]在探究雏鸡生长期间小肠的发育情况发现,十二指肠肠绒毛最早增长,且比空肠和回肠的绒毛长度更高,和本研究结果一致,十二指肠绒毛长度比其他2个肠段更长,且育雏温度30 ℃十二指肠的肠绒毛及肠隐窝显著高于其他2个温度组,说明育雏温度30 ℃对雏鸡十二指肠的肠道形态产生积极影响。肠绒隐比与肠上皮细胞的新陈代谢有关,比值升高表明肠道形态较好,消化吸收功能增强,比值降低则表明黏膜受损,消化吸收功能降低[26]。14日龄时,30 ℃组雏鸡十二指肠空肠绒隐比显著高于33 ℃组,说明30 ℃组雏鸡十二指肠和空肠发育更好,吸收营养能力更强。与本试验结果类似,Hammond等[27]将2种近亲小鼠在不同温度下饲养,发现适应低温环境的小鼠比适应高温的小鼠胃肠道发育更好。

葡萄糖是重要的营养物质,葡萄糖转运蛋白在哺乳动物细胞葡萄糖摄取和葡萄糖稳态中起着至关重要的作用[28]。GLUT2是转运吸收小肠葡萄糖的2个主要载体之一,在肠上皮细胞基底外侧发挥作用,将葡萄糖和果糖运输到血液循环中[29-30]。肠道中GLUT2的表达直接影响鸡肠道糖类营养物质的吸收。本试验结果表明,温度对空肠和回肠中GLUT2的表达量有更显著影响,尤其30 ℃组回肠一直高于27 ℃组,因此推测温度对卵黄囊吸收效果产生影响,进而影响雏鸡回肠营养吸收,且育雏温度30 ℃对雏鸡葡萄吸收的影响一直持续到雏鸡生长后期。张爱华[31]探究肉仔鸡肠道中PepT1的表达差异与发育规律后发现,雏鸡小肽吸收主要部位是十二指肠,回肠作用相对最小。本研究中,十二指肠中PepT1表达量高于空肠,回肠表达量最少,说明温度会影响PepT1的表达量,但不影响其主要吸收部位。Freeman等[32]在研究PepT1在消化道中的表达情况时也发现,PepT1 mRNA表达量在绒毛下部100～200 μm中迅速增加,在十二指肠和空肠肠细胞中最丰富,回肠上皮水平较低。本研究结果显示,在育雏期间,温度对卵黄囊的吸收产生影响,育雏温度30 ℃对雏鸡后期十二指肠及回肠产生积极影响,有助于营养物质吸收。

综上,育雏早期温度对雏鸡生长发育有显著影响,33 ℃育雏有助于前1.5 d卵黄囊吸收,30 ℃育雏有助于雏鸡体重增加、小肠形态发育、雏鸡免疫水平建立及肠道营养吸收相关基因的表达。