围产期湖羊能量负平衡下添加三丁酸甘油酯对羔羊瘤胃发酵指标及微生物多样性的影响

张昕乐,王智博,陈培勇,王远孝,张艳丽,王锋,尤佩华,樊懿萱*

(1.南京农业大学动物科技学院羊业科学研究所,江苏 南京 210095;2.柏斯托化工控股集团,瑞典 马尔默 20125;3.江苏波杜农牧股份有限公司,江苏 南京 211800)

在围产期,母体泌乳和胎儿生长发育对母羊摄取营养提出了巨大的挑战,胎儿在产前3周对营养物质的需求达到最高水平,而这一时期,母羊的干物质采食量却显著降低10%～30%[1],导致体内多种营养素严重缺乏,而能量负平衡则是这其中最为严重的一种营养应激状态[2]。因干物质采食量不足引发的能量负平衡,除了采取改善日粮适口性等措施增加采食量外,还可通过增加消化系统对饲料的吸收利用率来缓解。瘤胃在反刍动物的消化系统中扮演着最为重要的角色,其内部的微生物菌群结构的相对丰度将直接影响营养物质的消化和吸收[3-4]。研究表明,通过改变母羊妊娠至断奶的饲粮可以使羔羊瘤胃菌群结构发生变化[5]。Jami等[6]研究表明,出生至断奶是犊牛瘤胃微生物菌群建立并定型的时期,在断奶之后其多样性逐渐趋于稳定。瘤胃微生物不同菌群结构会造成羔羊在营养和能量代谢方面的差异,例如在挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)的合成表现上[7]。

三丁酸甘油酯(TB),化学式为C15H26O6,在脂肪酶的作用下可以分解为丁酸根和甘油。甘油可以被瘤胃微生物发酵产生挥发性脂肪酸,其中大部分是丙酸,而丙酸又是草酰乙酸和葡萄糖的前体[8]。Guo等[9]研究表明,每头奶牛饲粮中添加37.5 g·d-1三丁酸甘油酯不仅可以提高奶牛的生产性能,还对奶牛的乳房产生积极影响,提升围产期母畜生产性能将直接对羔羊瘤胃功能产生影响。额外的营养成分可以影响瘤胃核心群落结构而产生更多的VFA,对促进瘤胃发育及其功能的优化具有积极意义[10]。瘤胃在完全依赖富含纤维的食物之前会发生复杂的生理变化[11],早期营养干预可改变幼龄动物的微生物定殖模式[12-13],即在羔羊断奶前通过改善母羊营养状况可以使羔羊瘤胃向积极方向改变。羔羊日粮不同的营养成分会对其瘤胃微生物有影响,母乳补充TB可能会影响羔羊的瘤胃微生物[14]。本试验通过在能量负平衡下围产期湖羊的日粮中添加三丁酸甘油酯,间接改善羔羊营养摄入,探索该途径下羔羊瘤胃发酵指标及微生物多样性的变化,为三丁酸甘油酯在湖羊生产方面的进一步应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物、试验设计和饲养管理

本试验在启东瑞鹏牧业有限公司开展。依据生产记录选取20只体况相似、体重为(45±5)kg健康且怀双羔的产前50 d湖羊,随机分为2组,分别为能量负平衡(NEB)组和添加三丁酸甘油酯(TB)组。生产的羔羊采用人工定量饲喂对应组别母乳,分组为L-NEB和L-TB。正式试验期从母羊产前40 d至产后42 d,预期10 d。当羔羊42日龄时,分别从每组随机挑选5只屠宰,采集瘤胃内容物,测量其瘤胃发酵指标,并采用高通量测序技术分析其瘤胃微生物。试验羊采用分栏饲养,分别饲喂各组对应日粮。三丁酸甘油酯样品由柏斯托化工控股集团提供(福乐酸SR130,水解丁酸含量≥51.4%)。日粮配方如表1所示。TB组按照NRC标准饲喂(2.8 kg·d-1),NEB组母羊的每天饲料量为TB组的75%(2.1 kg·d-1),自由饮水。试验前对羊舍进行检疫消毒驱虫防疫,保持羊舍通风良好,自然光照,提前对羊群进行健康检查、驱虫和健胃。

表1 全价饲料配方及主要营养指标(以干物质计)Table 1 Full-price feed formula and main nutritional indexes %

1.2 样品采集

屠宰前对试验羊禁食24 h,不禁水。从胴体采集瘤胃内容物,测量其瘤胃发酵指标,并采用高通量测序技术对其瘤胃微生物进行分析。

1.3 pH值与VFA的测定

采用pH计测定瘤胃液pH值;参照Liu等[15]的方法测定VFA,其中气相色谱柱测定改为毛细管色谱柱,柱温120 ℃,汽化温度180 ℃,采用氢火焰离子化检测器,检测温度180 ℃,载气为氦气,压力为 60 kPa,氢气压力为50 kPa。

1.4 生物信息学分析

将样品送至广州基迪奥生物科技有限公司,采用Omicsmart平台进行高通量测序。利用双末端测序的方法构建小片段文库后进行测序。通过对reads拼接过滤,进行操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)聚类和物种分类分析,将序列相似度大于97%的聚类为同一OTU。同时使用Mothur v.1.30软件,对样品α多样性指数进行评估,得到稀释度曲线,Shannon、CHAO、ACE和Simpon指数用来评估样品的测序深度、菌群多样性。使用QIIME软件进行β多样性分析,得到β距离箱线图,再进行UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean)分析和主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)。

1.5 数据处理与统计分析

VFA含量及测序数据用Excel 2019进行初步整理,采用SPSS 25.0软件进行统计分析,结果中平均值和标准误(SE)分栏显示。

2 结果与分析

2.1 围产期添加三丁酸甘油酯对羔羊瘤胃发酵指标的影响

如表2所示,围产期添加三丁酸甘油酯后,42日龄羔羊瘤胃pH值无显著变化,乙酸含量显著升高(P<0.05),丙酸含量呈上升趋势。

表2 围产期添加三丁酸甘油酯对42日龄羔羊瘤胃发酵指标的影响Table 2 Effects of adding tributyrin on rumen fermentation indexes of 42 d lambs during perinatal period

2.2 围产期添加三丁酸甘油酯对瘤胃微生物α多样性的影响

如图1所示:本次测序共获得OTU 927条,其中,L-TB组与L-NEB组菌种差异较大,L-TB组有641条OTU,L-NEB组有745条OTU,L-TB组与L-NEB组共享的OTU共有459条,L-TB组特有182条,L-NEB组特有286条。L-TB组与L-NEB组OTU条数差异明显,说明围产期添加三丁酸甘油酯对羔羊瘤胃菌群有影响。微生物α多样性分析显示各组Shannon指数和Simpson指数均逐渐趋于平缓,说明样品的测序深度已满足试验要求。通过计算Shannon、CHAO、Simpson和ACE指数,发现L-NEB组的Shannon指数显著高于L-TB组(P<0.05),表明L-TB组羔羊的瘤胃微生物物种多样性显著低于L-NEB组。

图1 围产期添加三丁酸甘油酯对羔羊瘤胃微生物菌群多样性指数的影响Fig.1 Effects of tributyrin supplementation on microbial diversity index in rumen of lambs during perinatal period

2.3 围产期添加三丁酸甘油酯对瘤胃微生物β多样性的影响

与L-NEB组相比,L-TB组羔羊瘤胃的微生物群落构成存在一定差异却不显著(图2-A)。基于Weighted UnFrac距离的UPGMA聚类树(图2-B)显示,样品菌群结构基于母代是否饲喂三丁酸甘油酯大致聚集成2类,说明添加三丁酸甘油酯对羔羊的瘤胃菌群产生一定影响。通过PCoA分析(图2-C)可知,L-TB组和L-NEB组在瘤胃微生物群落组成上存在一定差异,且解释度好(横纵坐标轴标题括号里的百分比表示的是横纵坐标轴对菌群结构总体差异的解释度,一般认为PCoA1和PCoA2两者之和在50%以上为好)。

2.4 围产期添加三丁酸甘油酯后羔羊瘤胃微生物物种注释及差异分析

如表3所示:在门水平上,瘤胃微生物中主要菌群构成为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。L-TB组羔羊瘤胃中厚壁菌门的丰度相较L-NEB组显著上升(P<0.05),而蓝藻菌门丰度相较L-NEB组显著下降(P<0.05)。在属水平上,L-TB组羔羊瘤胃中厚壁菌门的Succiniclasticum和RuminococcaceaeUCG014丰度相较L-NEB组均显著上升(P<0.05)。

3 讨论

3.1 围产期添加三丁酸甘油酯对羔羊瘤胃发酵指标的影响

瘤胃作为反刍动物的第一胃,对反刍动物的健康和正常生长影响深远[16-17]。瘤胃pH值受唾液、食糜等多方面因素的影响,能够在一定程度上反映反刍动物的健康状况,通常认为羊瘤胃的正常pH值为5.0～7.5[18-19],L-TB与L-NEB的pH值均处于正常水平。有研究报道称,在瘤胃发酵中,丙酸含量的提高与羔羊的高生长性能有关[20]。从能量转化效率角度来看,瘤胃VFA中丙酸的能量转化效率最佳,丁酸次之,乙酸最差[21]。结合本试验测得VFA数据来看,围产期添加三丁酸甘油酯后,L-TB组乙酸含量显著升高,意味着有更多的脂质被合成,丙酸含量呈上升趋势,可以产生较多的葡萄糖用以供能。这说明在母羊围产期添加三丁酸甘油酯可在一定程度上改善羔羊对营养物质的消化吸收利用率。

3.2 围产期添加三丁酸甘油酯对瘤胃微生物α多样性和β多样性的影响

本试验结果显示,在OTU水平上,L-NEB组特有OTU数较L-TB组多104条,而L-NEB组的Shannon指数又显著高于L-TB组,表明L-TB组羔羊的瘤胃微生物物种多样性显著低于L-NEB组,提示添加三丁酸甘油酯显著降低了微生物多样性。有研究表明,三丁酸甘油酯可能通过抑制有害菌的生长,极显著降低了犊牛空肠以及结肠的微生物多样性[22],本试验结果与其一致。基于UPGMA聚类树和PCoA结果可以看出,L-NEB组和L-TB组羔羊瘤胃菌群结构存在一定差异却不显著,提示添加三丁酸甘油酯对羔羊的瘤胃菌群产生一定影响。

3.3 围产期添加三丁酸甘油酯对瘤胃微生物物种注释及差异的影响

门水平上的分析表明,相比L-NEB组,L-TB组羔羊瘤胃微生物中厚壁菌门的丰度显著提高,蓝藻菌门丰度显著下降。厚壁菌门中存在如乳酸菌、瘤胃球菌等多种有益菌[22],而蓝藻菌门中某些属的菌种易产各种各样的生物毒素,例如神经毒素、肝毒素、细胞毒素及内毒素等,对动物的健康构成严重危害[23]。Cox等[24]的研究结果表明,婴儿期的微生物群相互作用可能是长期宿主代谢效应的关键决定因素,厚壁菌门丰度的提升将可能长期有利于L-TB组羔羊瘤胃有益菌的定殖,为其营造健康瘤胃环境,而L-NEB组蓝藻菌门的丰度显著提升对该组的负面影响可能将长期存在。本试验中,门水平上丰度最高的微生物分别是厚壁菌门和拟杆菌门,这与反刍动物瘤胃微生物的其他研究结果相一致[25]。属水平上的分析表明,相比L-NEB组,L-TB组羔羊瘤胃微生物中Succiniclasticum和RuminococcaceaeUCG014丰度显著提高,而这两者又属于厚壁菌门,进一步印证添加三丁酸甘油酯有利于提升羔羊瘤胃厚壁菌门丰度,对有益菌的定殖提供有利条件。反刍动物围产期母体的营养环境对初乳的形成发挥着关键作用[26],而初乳又影响着羔羊瘤胃菌群结构,这可能与本试验所产生的影响相关。