葡萄VvGCN5基因的鉴定及互作蛋白筛选

陈雪琴,庞倩倩,裴丹,任艳华,房经贵

(南京农业大学园艺学院,江苏 南京 210095)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界上栽培最广的果树之一,具有极高的经济价值与营养价值[1],其果实的生长发育机制一直是研究的重点内容。组蛋白乙酰化是表观遗传学的关键内容,其状态由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰转移酶(HDAC)共同调控[2]。研究发现,组蛋白乙酰化在染色质修饰中发挥重要作用,能调节基因转录,诱导基因表达,影响各种生物过程,包括细胞分化、植物开花以及多种生物和非生物胁迫[3-4]。GCN5是一种重要的组蛋白乙酰转移酶,是GANT家族成员,负责组蛋白 H3 和 H4 的赖氨酸乙酰化,能通过与其他蛋白互作来影响植物多个生长发育过程[5]。目前,已有许多关于GCN5影响植物生长发育的报道,但是其基因功能的研究主要集中在模式植物拟南芥上。研究发现,拟南芥GCN5突变体会表现出花药发育异常、顶端优势缺失、矮化、分生组织功能异常、幼芽过度增殖、下胚轴变长、叶片毛状体密度增加、雄蕊数量和排列存在缺陷等现象[6-9]。此外,GCN5在植物体对非生物胁迫的响应中也发挥着重要作用。盐胁迫处理下,拟南芥和小麦中的GCN5表达量迅速上调,并且拟南芥GCN5突变体在盐胁迫条件下表现出严重的生长抑制和细胞壁完整性缺陷,表明GCN5在植物的耐盐性响应中发挥关键性作用[10]。

酵母双杂交系统也被称为相互作用系统,它能够在酵母体内检测蛋白之间的相互作用[11]。很多真核生物通常具有DNA特异结合域(DNA-binding domain)与转录激活域(transcriptional activation domain)2个可分割开的结构域,这2个结构域互不影响,都具有各自的功能。但是,只有这2个结构域同时存在才能激活转录反应。酵母双杂交系统不仅可以研究2个已知蛋白的相互作用,还可以利用cDNA文库筛选出与已知诱饵蛋白互作的多个蛋白,由于酵母双杂系统的假阳性较高,需配合双分子荧光互补(BIFC)等技术进行进一步阳性蛋白的验证与筛选[12]。因此,本试验对葡萄中的VvGCN5基因进行详细的生物信息学分析,包括基因的染色体定位、基因结构、启动子区域中顺式作用元件、蛋白的二级结构、抗逆相关表达量、时空表达等,同时,以pGBKT7-VvGCN5为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白,并使用BIFC技术进行验证,旨在为后期构建葡萄果实生长发育的表观遗传调控网络提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体与试剂

本试验涉及的所有质粒以及葡萄cDNA文库均来自本实验室。DH5α、EHA105、Y2HGold菌株以及Carrier DNA与LiAC/PEG均购于上海唯地生物技术有限公司。氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)、利福平(Rif)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、酵母缺陷型培养基(SD/-Trp,SDO)、酵母质粒提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。乙酰丁香酮(AS)、氯化钠、2-吗啉乙磺酸(MES)、无水葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉购自南京寿德生物试剂有限公司。α-半乳糖苷酶显色底物(X-α-Gal)购自上海生工生物技术有限公司。限制性内切酶BamHⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ、KplⅠ与YPD plus购自宝日医生物技术(北京)有限公司。氯化镁和腺嘌呤(Ade)购自上海麦恪林生化科技有限公司。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、同源重组试剂盒、基因克隆试剂盒(2×Phanta®Max Master Mix)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。酵母缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu,DDO;SD/-Trp/-Leu/-His,TDO;SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade,QDO)购自北京酷来搏科技有限公司。

1.2 生物信息学分析

利用NCBI数据库下载葡萄VvGCN5的蛋白序列、CDS序列、染色体位置;使用在线软件 PRABI对葡萄VvGCN5蛋白的二级结构进行预测;运用ExPASy预测蛋白的理化性质;通过PlantCARE网站,对VvGCN5的启动子顺式作用元件进行分析;利用InterProScan 网站对VvGCN5进行结构域以及GO分析;从NCBI的GEO数据库中查找生物或非生物胁迫下VvGCN5基因的表达量;在Grape eFP Browser网站中分析VvGCN5时空表达情况。

1.3 VvGCN5的亚细胞定位分析

以SalⅠ和KpnⅠ作为酶切位点,线性化pRI101-GFP载体,构建pRI101-VvGCN5-GFP重组载体,转化大肠杆菌感受态DH5α。将单克隆菌落利用pRI101通用引物(表1)进行PCR验证,条带正确的菌液送安徽生物通用公司进行测序。提取测序正确菌液的质粒,转化农杆菌感受态EHA105。将含有细胞膜Marker的菌液与pRI101-VvGCN5-GFP菌液共同瞬时注射于生长6～8周的本氏烟草叶片中。培养48 h后将叶片切成小块制成玻片,放到超高分辨率激光共聚焦显微镜(LSM800,Zeiss)下观察荧光表达情况。

表1 本试验所用的引物Table 1 Primers used in the experiment

1.4 酵母双杂交筛选VvGCN5的互作蛋白

以EcoRⅠ和BamHⅠ作为酶切位点,线性化pGBKT7载体,构建pGBKT7-VvGCN5重组载体,转化大肠杆菌DH5α。将单克隆菌落利用BD通用引物进行PCR验证并测序。将pGADT7与pGBKT7-VvGCN5共同转化酵母感受态Y2HGold中,涂板于DDO、DDO/X(添加了X-α-Gal的DDO)、QDO上检测VvGCN5自激活,并将质粒pGBKT7-VvGCN5与pGBKT7分别转化酵母感受态Y2HGold后涂板于SDO检测VvGCN5毒性,以排除VvGCN5蛋白自身对酵母双杂交的影响。

将葡萄cDNA文库质粒与pGBKT7-VvGCN5共转并涂布于50个DDO平板上,30 ℃培养3～4 d,将长出的菌落划线到QDO平板上。再将长出的菌落挑至1 mL DDO液体培养基中,30 ℃培养2 d后取2 μL菌液点到QDO/X平板上。将变蓝的菌落挑至1 mL DDO液体培养基中,30 ℃培养2 d后用AD通用引物进行PCR反应,PCR产物使用电泳检测,将目的条带送去安徽通用生物公司测序。

1.5 点对点验证

提取候选互作蛋白的酵母质粒,将质粒转化至大肠杆菌感受态DH5α中,以获得更高浓度的质粒。将高浓度质粒与pGBKT7-VvGCN5共转酵母感受态Y2HGold,涂布于DDO和QDO/X平板上。DDO平板上长出白色或粉色菌落且QDO/X平板上长出蓝色菌落,则认为该质粒为阳性质粒。将这些质粒对应的菌落挑至1 mL DDO液体培养基中,30 ℃培养2 d,取2 μL菌液点到DDO和QDO/X平板上。

1.6 双分子荧光验证候选蛋白互作关系

选择YNE(pSCYNE)和YCE(pSCYCE)为载体,以Xbal和BamHⅠ作为酶切位点,对YNE和YCE进行双酶切。将上述酵母双杂交筛选出的18个阳性基因分别与YCE和YNE载体连接,分别构建36个重组载体。同时,构建YCE-VvGCN5和YNE-VvGCN5重组载体。将需要进行互作验证的2个重组载体分别转化农杆菌EHA105中,利用瞬时注射法将2种菌液同时注射于生长6～8周的烟草叶片中,培养48 h后再将叶片用小刀切成小块制成玻片,放到超高分辨率激光共聚焦显微镜下观察520 nm处的荧光(YFP荧光蛋白设置为绿色)情况。

2 结果与分析

2.1 VvGCN5的生物信息学分析

利用在线网站对VvGCN5进行分析,发现VvGCN5位于7号染色体上,CDS序列长度共1 626 bp,编码541个氨基酸,其二级结构由37.15%的α-螺旋、11.65%的延伸链、5.36%的β-折叠以及45.84%的无规则卷曲组成(图1-A),并且VvGCN5含有10段内含子序列以及11段CDS序列(图1-B)。通过InterPro网站检索发现VvGCN5具有Acetyltransf_1和Bromodomain结构域。此外,VvGCN5还涉及蛋白结合(GO:0005515)、组蛋白乙酰转移酶活性(GO:0004402)以及N-乙酰转移酶活性(GO:0008080)3个功能。

图1 VvGCN5二级结构(A)与基因结构图(B)Fig.1 The secondary structure(A)and gene structure(B)of VvGCN5VvGCN5二级结构图中红色代表延伸链,蓝色代表α-螺旋,紫色代表无规则卷曲,绿色代表β-折叠。In secondary structure diagram of VvGCN5,red represents extended strand,blue represents α-helix,purple represents random coil,green represents β-sheet.

分析VvGCN5前2 000 bp启动子顺式作用元件(表2),发现VvGCN5具有ARE(厌氧诱导所必需的顺式调节元件)、GT1-motif(光响应元件)、TGACG-motif(参与 MeJA 反应的顺式调节元件)、CAT-box(与分生组织表达相关的顺式调节元件)、CGTCA-motif(参与 MeJA 反应的顺式调节元件)等顺式作用元件。这表明VvGCN5可能与光响应、分生组织表达、MeJA反应等功能有关。

在线网站NCBI的GEO数据库中提供了多个有关葡萄抗逆的RNA-seq 数据。由图2可见:在GEO项目GSE129046[13]中,‘巨峰’和‘阳光玫瑰’经过壳聚糖处理后,VvGCN5表达量升高,特别是‘阳光玫瑰’经过壳聚糖处理后,VvGCN5表达量上升了25%。在GEO项目GSE116274[14]中,‘卡尔卡耐卡’浆果感染灰霉病后,VvGCN5表达量降低,推测VvGCN5可能与灰霉病有关。在GEO项目GSE157347[15]中,在葡萄转色期进行摘叶,待浆果完全成熟后,VvGCN5的表达量下降,表明VvGCN5可能与光照有关。

图2 GEO项目中不同处理的VvGCN5表达量Fig.2 Expression levels of VvGCN5 of different treatments in the GEO projectA. GEO项目GSE116274中,CK1代表‘卡尔卡耐卡’未感染灰霉病;GEO项目GSE129046中,CK2表示‘巨峰’和‘阳光玫瑰’受到灰霉病感染;B. CK表示不作处理。A. In GSE116274 of the GEO project,CK1 represents that ‘Calkanika’ berry is not infected with gray mold;in GSE129046 of the GEO project,CK2 represents that‘Kyoho’and‘Sunshine Rose’are infected with gray mold;B. CK means no treatment.不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different small letters indicate significant difference at 0.05 level.

通过在线网站Grape eFP Browser分析发现,VvGCN5(VIT_07s0141g00140)主要表达于葡萄的成熟茎、萌芽初期、心皮、种子上。对于葡萄浆果而言,自转色期后,VvGCN5的表达量逐渐下降[16]。

2.2 VvGCN5的亚细胞定位

为了明确VvGCN5的表达位置,将含有膜Marker与pRI101-VvGCN5-GFP表达载体的悬浮液注射于烟草叶片中,培养48 h,用激光共聚焦显微镜观察,发现膜Marker显示出红色信号,表明是烟草的细胞膜;表达载体pRI101-VvGCN5-GFP显示出绿色荧光信号,且信号表达强烈(图3),表明pRI101-VvGCN5-GFP定位于细胞膜和细胞核上。

图3 pRI101-VvGCN5-GFP的亚细胞定位图Fig.3 Subcellular localization of PRI101-VvGCN5-GFP

2.3 诱饵载体pGBKT7-VvGCN5的毒性与自激活验证

pGBKT7-VvGCN5与pGBKT7分别转化酵母感受态,涂于SDO平板后,发现平板A和平板B的菌落数量相似(图4),表明诱饵载体pGBKT7-VvGCN5不会影响酵母生长,无毒性。将pGBKT7-VvGCN5和pGADT7共转酵母感受态,分别涂布于DDO、DDO/X、QDO平板上,结果(图5)表明,DDO与DDO/X上均长白色菌落,QDO上不长菌落。这表明pGBKT7-VvGCN5没有自激活。

图4 诱饵载体pGBKT7-VvGCN5的毒性检测Fig.4 Toxicity detection of the baitvector pGBKT7-VvGCN5A. pGBKT7-VvGCN5转化的SDO平板SDO plate transformed with pGBKT7-VvGCN5;B. pGBKT7转化的SDO平板SDO plate transformed with pGBKT7.

图5 诱饵载体pGBKT7-VvGCN5的自激活检测Fig.5 Self-activation detection of bait vector pGBKT7-VvGCN5A. pGBKT7-VvGCN5+pGADT7转化的DDO平板DDO plate transformed with pGBKT7-VvGCN5+pGADT7;B. pGBKT7-VvGCN5+pGADT7转化的DDO/X平板DDO/X plate transformed with pGBKT7-VvGCN5+pGADT7;C. pGBKT7-VvGCN5+pGADT7转化的QDO平板QDO plate transformed with pGBKT7-VvGCN5+pGADT7.

2.4 酵母双杂交筛选VvGCN5的互作蛋白

将葡萄cDNA文库质粒与pGBKT7-VvGCN5共转至酵母感受态中,涂布50个DDO平板,再将平板上长出的菌划线至QDO上,共长出93个菌落。将这93个菌落点板至QDO/X上,共发现58个菌落变蓝。将58个菌落进行测序,去掉重复数据后获得了32个候选阳性克隆。进一步进行点对点验证,发现只有18个菌落能够在QDO/X平板上生长并变蓝。将这18个菌落对应的蛋白序列作为候选互作蛋白,其基因信息如表3所示。

将这18个菌落挑至1 mL DDO液体培养基中,30 ℃培养箱静置2 d后,取2 μL菌液点到DDO平板和QDO/X平板上,结果(图6)发现,阳性对照pGBKT7-53+pGADT7-T的DDO平板上长白色菌落,QDO/X平板上长出蓝色菌落;阴性对照pGBKT7-Lam+pGADT7-T的DDO平板上长白色菌落,QDO/X平板上不长菌落。

图6 阳性质粒与pGBKT7-VvGCN5的点对点验证Fig.6 Point-to-point verification of positive plasmids and pGBKT7-VvGCN5pGADT7-T+pGBKT7-53为阳性对照,pGADT7-T+pGBKT7-Lam为阴性对照。P1—P18同表3。下同。pGADT7-T+pGBKT7-53 is used as positive control,and pGADT7-T+pGBKT7-Lam is used as a negative control. P1-P18 are same as Table 3. The same as follows.

2.5 双分子荧光验证候选互作蛋白

利用双分子荧光互补技术对上述18个候选互作蛋白进行验证,结果(图7)表明,有8个蛋白依然与VvGCN5互作,分别是:SYT2(P1)、P5βR(P5)、GFA2(P9)、胞质GAPDH(P11)、OLA1(P12)、probable XTH 32(P13)、FKBP20-1(P14)、rTl-Cyn(P15)。其中,对照组YCE+YNE未发现有YFP荧光。SYT2(YCE-P1+YNE-VvGCN5)、GFA2(YCE-VvGCN5+YNE-P9)、胞质GAPDH(YCE-P11+YNE-VvGCN5)、rTl-Cyn(YCE-P15+YNE-VvGCN5)荧光主要出现在细胞膜上。FKBP20-1(YCE-P14+YNE-VvGCN5)与VvGCN5组合的荧光主要出现在细胞膜和细胞核上,且信号强烈。P5βR(YCE-P5+YNE-VvGCN5)、OLA1(YCE-VvGCN5+YNE-P12)与VvGCN5组合的荧光主要出现在细胞核上,其次出现在细胞膜上。probable XTH 32(YCE-P13+YNE-VvGCN5)与VvGCN5组合的荧光主要出现在细胞膜和细胞质上。

图7 双分子荧光互补技术检测YNE-VvGCN5/YCE-VvGCN5与候选阳性蛋白在植物体内的相互作用Fig.7 The detected interaction between YNE-VvGCN5/YCE-VvGCN5 and candidate positiveproteins in plants detected by bimolecular fluorescence complementation technology

3 讨论

GCN5是一种重要的组蛋白乙酰转移酶,在植物的生长发育调控与非胁迫反应中发挥着重要作用。本研究表明,VvGCN5由α-螺旋、延伸链、β-折叠以及无规则卷曲构成,含有Acetyltransf_1和Bromodomain结构域,Acetyltransf_1结构域与N-乙酰转移酶活性有关,Bromodomain结构域在转录激活中发挥作用。同时,分析VvGCN5启动子顺式作用元件发现:CAAT-box和TATA-box相关顺式元件最多,表明VvGCN5与转录密切相关;并且VvGCN5还涉及激素响应元件,包括MeJA、水杨酸响应元件,表明VvGCN5的表达水平可能一定程度上受MeJA、水杨酸诱导。有研究表明,GCN5能通过抑制水杨酸积累的方式参与植物对生物胁迫的响应[17]。VvGCN5也涉及光响应元件。通过分析GEO数据库中包含VvGCN5的RNA-seq发现,VvGCN5可能与光照有关。Benhamed等[18]发现拟南芥中GCN5参与光调节植物发育过程。对于葡萄浆果而言,自转色期后,VvGCN5的表达量逐渐下降,推测VvGCN5主要调控葡萄转色期前的生长发育过程。本研究亚细胞定位发现VvGCN5位于细胞膜和细胞核上,这与Chang等[19]的研究结果相似。

酵母双杂交是一种研究体内蛋白与蛋白互作的方法,原理是利用Y2HGold中的报告基因筛选与诱饵蛋白互作的猎物蛋白。前人的研究中,AtGCN5和AtADA可以与冷诱导转录激活因子(CBF1)相互作用,影响冷诱导基因的表达[20];同时,AtGCN5还可以与CLAVATA1 相互作用[21],影响拟南芥的乙烯反应。

本试验中,酵母双杂交与双分子荧光技术分析结果表明,SYT2、P5βR、GFA2、胞质GAPDH、OLA1、probable XTH 32、FKBP20-1、rTl-Cyn与VvGCN5直接互作。突触结合蛋白2(SYT2)在花粉粒中高度表达,在花粉萌发和花粉管生长过程中起重要作用,并参与常规的分泌过程[22],表明VvGCN5可能通过与SYT2互作来影响花粉的萌发与花粉管的生长。拟南芥中,SYT2被发现定位于质膜和高尔基体上[22],本试验与之相似,SYT2与VvGCN5组合的荧光主要分布在细胞膜上。据报道,低温或高盐浓度等环境压力会上调拟南芥中P5βR的表达[23]。此外,当P5βR被敲除时,拟南芥的叶脉图案改变,茎和根中维管束的发育减少[24]。研究发现,P5βR与VvGCN5组合的荧光主要分布在细胞核和细胞膜上,表明VvGCN5可能通过与P5βR互作来影响植物的叶脉图案、根和茎中的维管束等。GFA2在整个植物中都会表达[25]。此外,GFA2是线粒体J结构域蛋白(JDP)的直系同源物,线粒体 JDP油菜素不敏感长下胚轴2(BIL2)是BR生物合成的抑制剂[26],表明GFA2也可能与油菜素内酯生物合成有关。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是一种多功能蛋白,在各种细胞功能中发挥作用,能影响多个植物生长进程和非生物胁迫[27-31]。研究发现,VvGCN5与胞质GAPDH蛋白在细胞膜上互作。OLA1(Obg样ATPase 1)是 YchF 亚家族 GTPase 中新发现的 ATPase 成员[32],它能影响耐热性和HSP70 蛋白的表达水平,并通过转录独立机制在细胞抗氧化反应中发挥负调节作用[33]。而VvGCN5与OLA1在细胞核上互作。木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶(XTH)是一种细胞壁修饰酶,通常与细胞扩增相关[34]。XTH-32是编码木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶的基因之一,它能转录调控响应铝胁迫的XET活性的表达。本研究发现,VvGCN5能与XTH-32蛋白在细胞膜上互作。肽基脯氨酰顺反异构酶(FKBP)参与了许多生物过程,包括激素信号转导、植物生长等[35]。据报道,TaFKBP20-1位于细胞核上[36],本研究与之相似,VvGCN5能与FKBP20-1蛋白在细胞核和细胞膜上互作。rTl-Cyn(氰酸水合酶)在依赖碳酸氢盐和不依赖水的反应中,能够完全分解有毒氰酸盐并生成氨和二氧化碳[37],增强植物对氰酸盐的抵抗力。VvGCN5能与FrTl-Cyn蛋白在细胞膜上互作,表明VvGCN5可能通过调控FrTl-Cyn蛋白的表达,从而调节植物对氰酸盐的抵抗性。

综上,VvGCN5可能通过与这8个蛋白互作并调控其基因的表达来调节花粉萌发、叶脉图案、果实软化等多个葡萄生长发育过程,而具体的调控途径还有待进一步的研究。