低温诱导芹菜种子次生休眠及其调控机制

李涵,阎君,吴珏,黄志午,朱明芬,范林华,朱为民,4*,徐志刚*

(1.南京农业大学农学院,江苏 南京 210095;2.上海农业科学院设施园艺研究所,上海 201403;3.上海市奉贤区农业技术推广中心,上海 201499;4.南京农业大学园艺学院,江苏 南京 210095)

种子是植物重要的传播单位,在自然条件下,脱离母体后种子的顺利萌发对植物种群的繁衍具有重要意义[1]。植物进化出很多策略调节萌发过程,其中种子休眠是植物应对环境变化并确保种子能够在适宜环境萌发重要手段[2]。休眠是植物生长发育过程中的一个暂停现象[3],广义上的休眠是指具有正常活力的完整种子在适宜的环境中不能萌发的现象[4-5]。但经过多年对不同物种的研究,研究者对植物种子的休眠类型进行了不同的分类:Bewley[6]和Hilhorst[7]将种子休眠分为种子成熟就获得的初生休眠和由环境引起的次生休眠2类;Baskin等[8]和Baskin等[9]将种子的休眠类型进行了扩展,增加了新的休眠类型,包括生理休眠、形态休眠、形态生理休眠、物理休眠和组合休眠。

尽管种子休眠在农业生产中具有一定的意义,但休眠造成的萌发延迟对实际生产产生了极大的麻烦。在众多环境因子中,温度被认为是影响种子休眠和萌发的最重要的环境因素之一[10]。适度的低温处理已被证实能解除拟南芥(Arabidopsisthaliana)[11]、丁香(SyringaoblataLindl)[12]、羊草(Leymuschinensis)[13]等多种植物的初生休眠并刺激萌发,对拟南芥的广泛研究也证明适度的低温能够促进赤霉素(GA)合成并加速脱落酸(ABA)降解[11,14]。越来越多的证据表明,GA/ABA是温度调控种子萌发的关键信号[15]。近年来极端天气出现的概率增加,作物种子在田间播种后遭遇低于萌发温度的低温易诱发次生休眠,不仅减少出苗率更会影响产量。

芹菜(ApiumgraveolensL.)是广泛种植的蔬菜作物,性喜凉,在国内外栽培广泛[16]。芹菜种子是典型的形态休眠类型,即种子成熟时胚未发育成熟,胚占整个种子体积小,萌发时易受环境影响[17]。在本课题组的前期研究中发现,5 ℃低温会明显抑制芹菜种子萌发,而20 ℃的亚低温则能明显促进种子萌发。为了解析5 ℃低温对芹菜种子萌发的抑制机制,本研究分别对芹菜种子进行5和20 ℃处理,并从GA和ABA的含量,合成、降解和信号传导基因的动态变化等方面展开研究,以期揭示芹菜种子应对低温的生理响应机制,为后续抗寒机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 萌发试验

供试品种为‘上海黄心芹’,选取外形饱满均匀无病变的种子,置于培养皿中,并加入适量蒸馏水,随后将培养皿置于5和20 ℃培养箱中,每日记录萌发种子数量。5 ℃处理进行到15 d时,将种子转移至20 ℃,每日记录萌发种子数量,并将其命名为T5-20。所有萌发试验共3个重复,每个重复40粒种子。

称取0.1 g干种子,用纱布包裹后放于烧杯并加入蒸馏水没过其表面,随后将烧杯放于5和20 ℃培养箱中,前12 h每隔2 h将种子取出,擦干水分并称重,12 h后每隔1 d称重。每个处理3次重复,按照公式计算相对吸水量:相对吸水量=(mn-m0)/m0×100%[18]。式中:m0为初始干种子的质量;mn为某个检测时间点称取的种子质量。

提前在穴盘中装满有机基质,将在5和20 ℃分别浸种12 h的种子点播于穴孔中,并将穴盘置于 5和20 ℃培养箱中观察出苗率,共观察20 d,每个重复20粒种子,共重复3次。

用刀片将不同萌发时间的种子从中间剖开,并将半粒种子置于显微镜下拍照,利用Powerpoint统计照片中胚与整个种子的比例(胚率),每个时间每个处理共选择10个种子进行检测。

1.2 RNA提取及RT-qPCR

使用Trizol提取芹菜种子RNA,5 ℃处理分别在1、2、3、5、9、16、17、20 d时取样;20 ℃处理分别在1、2、3 d时取样;T5-20分别在转入20 ℃后的1和2 d取样,即5 ℃处理的16和17 d,由于转入20 ℃后2 d时已经有种子萌发,因此在取样时仅选取未萌发的种子。

反转录及RT-qPCR反应均使用反转录试剂盒(TaKaRa,日本),反应体系参照说明书。引物参考Walker等[19]的研究,并使用Primer 3(https://primer3.ut.ee/)重新设计,以GAPDH为内参基因,具体引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequence for RT-qPCR

1.3 赤霉素及脱落酸含量测定

使用上海酶联生物的Elisa试剂盒测定赤霉素及脱落酸含量,5 ℃取样时间为1、2、3、5、9、16、17、20 d,20 ℃取样时间为1、2、3 d,T5-20分别在转入20 ℃后的1和2 d取样,具体步骤参照说明书进行,重复3次。

1.4 种子活力、淀粉及可溶性糖含量测定

种子活力染色采用TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)法,将红四氮唑配制成0.5%的溶液,将种胚完整取出后浸入TTC溶液中染色2 h并拍照。采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒测定淀粉及可溶性糖含量,5 ℃取样时间为1、2、3、5、9、15、20 d,20 ℃取样时间为1、2、3 d,具体步骤参照说明书,重复3次。

1.5 数据处理

利用Microsoft Excel 2013软件整理数据,采用Origin 2017软件绘图,借助SPSS 25软件利用单因素方差分析(ANOVA),选用Duncan’s检验和t检验对不同处理进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同温度处理对芹菜种子萌发的影响

由图1可见:5 ℃处理显著抑制芹菜种子的萌发能力,在长达20 d的时间里没有种子萌发;20 ℃处理可以显著促进种子萌发,最终萌发率达到83%,萌发率和发芽指数显著高于5 ℃处理。对不同温度处理的芹菜种子出苗率分析后发现,20 ℃下种子出苗率可达80%,5 ℃没有种子出苗(图1-E)。对5和 20 ℃处理种子的相对吸水量测定后发现,20 ℃处理种子的相对吸水量呈明显的“S”曲线,前12 h种子的吸水速度较快,为吸涨吸水期,12 h至3 d吸水速度放缓,为吸水滞缓期,4 d种子开始萌发,胚根突破种皮后需水量增加,进入主动吸水期;5 ℃处理的种子在吸水饱和后即进入吸水滞缓期,并且相对吸水量始终小于20 ℃处理的种子(图1-B、F)。

为了观察不同温度下芹菜种子胚的生长速度,对芹菜种子的胚率进行了测定,结果发现20 ℃处理下芹菜种子的胚生长迅速,3 d时胚率已经达到0.724,但5 ℃处理种子的胚生长异常缓慢,尽管20 d时的胚率(0.704)与20 ℃处理3 d的没有显著差异,但仍然小于20 ℃处理(图1-G)。由于我们观察到5 ℃处理种子在15 d时的胚率与20 d没有显著差异,同时也为了探究5 ℃低温是否对芹菜种子产生了不可逆的影响,将5 ℃处理15 d的种子转移至20 ℃中(T5-20),结果发现,在转入20 ℃的2 d(5 ℃的17 d)种子便开始萌发,在20 d时萌发率达到了68.3%(图1-B、C、G)。

综上所述,我们认为5 ℃低温使芹菜种子发生了次生休眠,这使得在长达20 d的时间芹菜种子无法完成萌发过程,并且5 ℃低温也抑制了芹菜种子的吸水速度和胚生长。

2.2 不同温度处理后芹菜种子赤霉素含量及相关基因表达情况

对不同温度处理下芹菜种子的赤霉素(GA)含量动态变化进行测定后发现,20 ℃处理种子的GA含量在1～3 d持续增加,而5 ℃处理种子在2 d有小幅增加后又持续降低,20 d又有所增加。另外,对经5 ℃处理15 d后转入20 ℃的种子(T5-20)的GA含量进行测定后发现,转入20 ℃的种子GA含量与同时期5 ℃处理的种子相比明显增加(图2-A)。

图2 不同温度处理下芹菜种子赤霉素含量(A)及代谢相关基因表达量(B—G)Fig.2 Gibberellin content(A)and metabolism-related gene expression(B-G)in celery seedsunder different temperature treatments

对GA代谢通路中的关键基因表达情况进行测定后(图2-B—E)发现,5 ℃处理种子的GA合成基因(GA3ox1、GA3ox2、GA20ox3)以及GA降解基因(GA2ox6)表达量整体均呈下调趋势,T5-20处理的种子与5 ℃处理种子没有明显差异,3个基因始终表达量很低;而20 ℃处理种子的GA3ox2、GA20ox3以及GA2ox6在萌发前3 d均表现为先下调再上调,但GA3ox1的表达却明显上调,并且其表达量也明显高于同时期5 ℃处理种子,GA3ox1在T5-20处理后同样出现上调,这说明20 ℃适温可能主要是通过调控GA3ox1的表达来促进GA合成。

GID1是GA的受体蛋白,其编码基因在5 ℃始终低表达,20 ℃下GID1先下调再上调,但T5-20处理却没有增加其表达(图2-F);GAI是GA下游的转录因子,对种子萌发起抑制作用,20 ℃处理后其表达量在1 d明显下降,随后始终低表达,在5 ℃其表达量多有起伏,与5 ℃相比,T5-20处理2 d的GAI先明显下调随后又上调(图2-G)。

2.3 不同温度处理后芹菜种子脱落酸含量及相关基因表达情况

对不同温度处理种子脱落酸(ABA)含量的动态变化进行测定后发现,尽管20 ℃能有效促进种子萌发,但ABA含量在1～3 d一直增加;5 ℃处理种子在3 d时的ABA含量变化趋势与20 ℃非常相似,但随后ABA含量下降,10 d含量最低,随后又一定程度增加;T5-20处理种子的ABA含量明显低于同时期的 5 ℃处理(图3)。

对ABA代谢及信号传导基因的表达情况进行测定后发现,20 ℃处理种子的ABA合成基因(ABA1、NCED5、NCED6),ABA降解基因(CYP707A1)以及下游转录因子(ABI5和ABF2)均在萌发前2 d下调表达,随后又在3 d时上调表达。5 ℃处理种子的各个基因除CPY707A1外均在3 d时明显下调,另外ABA1基因在3 d后的表达趋势与ABA含量变化趋势较为相似,NCED5的表达量在16、17和20 d时一直上调表达,可能对萌发后期的ABA合成起促进作用。ABA下游的ABI5和ABF2表达量则始终维持较低水平(图3-H、I)。另外,负责ABA降解的CPY707A1表达量在种子萌发中后期与5 ℃处理种子的ABA含量基本呈相反的趋势,例如,其在9 d时表达量达到最高,而ABA含量在9 d时最低。T5-20处理的种子ABA含量相比5 ℃处理明显降低,T5-20处理的CPY707A1表达相比同时期的5 ℃处理显著上调,而NCED5表达又显著下调,T5-20处理其他基因表达趋势与5 ℃处理没有明显差异。

对不同温度处理下种子的GA/ABA比值进行分析后发现,20 ℃处理和T5-20处理种子的GA/ABA均在萌发时呈上升趋势;5 ℃处理3 d的ABA含量增加,但GA/ABA却明显下降,尽管5 ℃处理9 d时 GA/ABA 有小幅增加,但随后又呈下降趋势。

2.4 不同温度处理对芹菜种子活力及糖代谢的影响

对5 ℃处理20 d的种子和20 ℃处理3 d的种子进行种子活力染色,结果(图4-A)发现,在经过2 h的染色后,5和20 ℃处理种子的种胚均能被染成红色,这也进一步说明5 ℃处理尽管降低了种子的萌发活力,但却未对种子结构造成不可逆伤害。

对种子萌发期间的可溶性糖和淀粉含量进行测定,结果(图4-B、C)发现,20 ℃处理明显促进淀粉分解和可溶性糖含量增加,而5 ℃低温处理后淀粉的分解速度和可溶性糖含量增加却异常缓慢,这说明5 ℃低温明显抑制芹菜种子的糖代谢能力,进而影响糖分分解为胚生长提供能量的过程。

3 讨论

初生休眠的产生与解除机制一直是种子科学研究的重点,在以拟南芥为代表的模式植物中已经有比较深入的研究。然而,关于种子次生休眠的研究却相当有限。尽管温度是影响种子季节性休眠与解除的关键环境信号,但当前的研究大多关注由高温引起的“热休眠”,对低温引起的次生休眠研究相对较少。因此,本研究以前期研究为基础,选择能有效促进芹菜种子萌发的20 ℃亚低温和能明显抑制种子萌发的5 ℃低温为试验条件,探究低温对芹菜种子次生休眠的产生和作用机制。

本研究发现,20 ℃处理种子的萌发率和发芽指数显著高于5 ℃处理,在20 d内5 ℃处理没有种子萌发,并且5 ℃低温处理的芹菜种子出苗率为0%,这说明在实际生产中芹菜播种后遭遇低温天气极有可能对最终产量产生重大影响。本研究也发现低温会明显抑制芹菜种子的吸水速度,导致主动吸水期始终没有出现,这与陈昊等[18]关于花生(ArachishypogaeaL.)种子的研究结果类似。另外,低温还抑制了芹菜种子胚的生长,20 ℃处理3 d的种子胚率为0.724,尽管5 ℃处理种子20 d时胚率与20 ℃处理3 d没有显著差异,但仍然低于20 ℃处理;并且5 ℃处理15 d时胚率与20 d同样没有显著差异,这说明在低温条件下,种胚的生长速度愈加缓慢。

目前,种子休眠的激素调控理论是被普遍接受的[20]。Li等[21]发现15 ℃低温会抑制不耐低温水稻品种的GA合成,多个GA合成基因的表达也被抑制。Yamauchi等[11]发现拟南芥在4 ℃中能有效解除初生休眠,并且4 ℃低温能明显促进GA合成基因AtGA20ox1、AtGA20ox2和AtGA3ox1的表达,但GA降解基因AtGA2ox2的表达被4 ℃低温明显抑制。但在本研究中却有不同的结果,与5 ℃低温相比,20 ℃亚低温能够明显促进种子萌发期和T5-20处理中GA的合成,并且GA3ox1的表达在20 ℃和T5-20处理中均被上调,此外GA2ox6的表达被20 ℃处理抑制;而5 ℃低温明显抑制了GA的合成,同时GA的合成、降解以及下游受体和信号基因的表达也被5 ℃抑制。据此推测,GA3ox1基因可能对芹菜种子在适宜环境中的GA合成发挥关键作用,而低温对GA的代谢及信号通路均有抑制,阻碍GA发挥作用。

在拟南芥中,4 ℃低温会诱导ABA合成并且抑制ABA分解基因CYP707A1的表达[11]。10 ℃低温可以促进甜菜(BetavulgarisL.)种子ABA的降解,ABA的多个合成及降解基因分别被抑制与促进表达[22]。本研究发现,在低温环境下芹菜种子萌发的不同时期可能有不同的代谢基因发挥主要作用。5 ℃低温环境下ABA含量在前3 d持续增加,但本研究检测的相关ABA合成基因却始终维持低表达,相反,ABA降解基因却在萌发早期有较高表达。类似情况在20 ℃处理中也有发现,尽管20 ℃处理环境下芹菜种子ABA含量在前3 d不断增加,但相关ABA合成基因却同样表达量较低,而CYP707A1表达量却在上调。在5 ℃处理芹菜种子萌发的中后期则发现ABA降解基因CYP707A1表达量与ABA含量有明显的负相关趋势,而ABA合成基因ABA1和NCED5则与ABA含量有明显正相关趋势。T5-20处理中ABA含量相比5 ℃处理明显下降,CYP707A1的表达明显上调。因此,与ABA相关代谢基因的功能对不同温度环境的响应还有待进一步研究。

尽管20 ℃处理种子在萌发期间ABA含量不断增加,GA/ABA在萌发期同样持续增加,但5 ℃处理种子的GA/ABA整体呈下降趋势。Finch-Savage等[5]提出GA和ABA通过合成和分解代谢的动态平衡来影响 GA/ABA,这能够改变种子对周围环境的敏感性进而调节萌发过程。目前拟南芥[20]、大豆[23]、阿拉伯岩芥[24]等物种的研究均指出GA/ABA(即GA与ABA的动态变化)才是影响种子萌发的关键信号。另外,T5-20处理中的GA/ABA相比同时间的5 ℃处理种子也明显增加,因此认为相比于GA与ABA绝对含量,GA/ABA可能才是芹菜种子响应环境温度并调节萌发的关键信号。

研究提出,赤霉素和脱落酸协同调控种子萌发的机制可能与它们共同调控种子中α-淀粉酶基因有关[25]。可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质和能量代谢物质,种子萌发时淀粉被α-淀粉酶在内的多种酶分解为小分子糖类参与氧化供能,GA可以与α-淀粉酶合成基因上游启动子的GA应答元件结合促进其转录[25],而ABA作用则相反[26]。本研究发现,20 ℃亚低温促进了芹菜种子赤霉素的合成,并且在种子萌发过程中淀粉含量显著下降,而可溶性糖含量显著上升,但5 ℃低温则明显抑制了淀粉分解,因此推测GA可能参与了芹菜种子中的糖代谢过程,其机制还有待进一步研究。

综上所述,与20 ℃相比,5 ℃明显抑制了种子的萌发率、相对吸水量与出苗率,可能会对实际生产过程产生重大影响。5 ℃低温处理抑制了GA与ABA之间的动态平衡以及信号通路中关键基因的表达,并且芹菜种子的糖代谢供能也明显被抑制,这使得种胚的生长异常缓慢,无法完成萌发过程,但5 ℃低温并没有对胚结构造成不可逆伤害;20 ℃处理促进了GA和ABA的合成,但GA/ABA在萌发期的增加可能才是芹菜种子响应温度并调节萌发的关键信号,并且20 ℃处理还促进了可溶性糖含量的增加,增强了萌发期间的糖代谢能力。因此,本研究认为5 ℃低温诱导芹菜种子发生了次生休眠,但在低温早期ABA的代谢调控过程还有待进一步研究。