不同激素和预处理时间对辣椒花药培养的影响

程志芳，韩娅楠，董晓宇，常晓轲，姚秋菊

（河南省农业科学院园艺研究所 郑州 450002）

辣椒（Capsicum annuumL.）属于茄科辣椒属蔬菜，为异花授粉植物。按照传统育种方法，培育一个自交系至少需要5 代，周期长，费时费力，而通过辣椒花药培养技术仅通过1～2 代即可得到纯合二倍体材料，缩短了育种年限，同时提高选择效率，增加遗传类型，甚至筛选到突变体[1]。自1964 年印度学者Guha 和Maheshwari[2]通过毛曼陀萝的花药培养成功获得单倍体植株以来，花药培养获得突破性进展。1973 年，王玉英等[3]和George 等[4]首次成功获得了C.annuum辣椒花药培养的再生植株。之后很多学者对如何提高辣椒花药培养效率进行了研究。但大多集中在花蕾预处理方法[5-6]、外植体消毒方法[7-8]、培养基选择[9-12]、碳源选择[13]和激素组合[13-17]应用上。而在激素组合应用方面多是利用NAA 与KT 组合进行辣椒花药培养，且许多研究者[13，18-19]认为0.5 mg·L-1NAA 与1.0 mg·L-1KT 组合最适合辣椒花药培养。另有前人研究表明，2，4-D 和KT 组合在花药培养中亦可直接诱导出胚状体[20-21]。而在辣椒花药培养方面，针对2，4-D 对辣椒花药培养的影响研究较少。仅有的少量相关研究结果表明[6，22-23]，低浓度的2，4-D 与KT 组合可诱导辣椒花药产生胚状体。笔者以15 个不同类型的辣椒品种为试材，采用MS 培养基，比较了不同品种、2，4-D或NAA 与KT 激素组合以及预处理时间对辣椒花药培养的影响，旨在为提高辣椒花药培养效率提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

参试的15 个不同类型的辣椒品种见表1。于2020 年1 月底播种，4 月下旬定植于河南省农业科学院现代农业研究开发基地露地试验区。5 月中下旬至6 月中下旬采摘初花期和盛花期花蕾，上午8：00左右取样，选取萼瓣等长或花瓣稍露出花萼的花蕾（此时小孢子大部分处在单核靠边期），4 ℃低温预处理1～7 d。将经过预处理的花蕾，在超净工作台上用70%乙醇浸泡消毒30 s，再用0.1%HgCl2浸泡10 min，无菌水冲洗4～5 次。置于铺有无菌滤纸的培养皿中，用镊子和解剖刀剥开花蕾，取出花药，接种在培养基上，用para-film 封口。32 ℃恒温暗培养7 d，之后26 ℃下暗培养至有胚状体长出，将其转入无任何添加物的MS 培养基，培养条件为26 ℃，光周期为12 h·d-1，直至其分化成苗。

表1 供试辣椒的品种和类型

1.2 试验设计

试验采用完全随机设计方法，探究了品种、激素和预处理时间3 个因素对辣椒花药培养的影响。每处理2～3 皿，每皿接种30 个花药，3 次重复。所有试验以MS 为基本培养基，添加30.0 g·L-1蔗糖，4.0 mg·L-1AgNO3，3.0 g·L-1活性炭和8.0 g·L-1琼脂，调节pH 值为5.8。

1.2.1 品种筛选 将上述15 个不同类型辣椒品种的花药接种在m2培养基（MS+1.0 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1KT）上，筛选出花药培养效率较高的品种。

1.2.2 不同激素诱导培养基 将前期筛出的高效品种的花药接种于m1、m2、m3等3 种培养基上。m1、m2、m3等3 种培养基的外源激素种类及其浓度见表2，从中筛选出适用品种较多的高效培养基配方。

表2 培养基中添加的激素种类及浓度

1.2.3 不同预处理时间 以华之秀2 号的花药为试材，分别经历1、2、3、4、5、6、7 d 的4 ℃低温预处理后接种于m3培养基上。

1.2.4 指标测定 接种20 d 后每周调查1 次胚状体萌发状况，直至接种后80 d 统计出胚率、成苗率和畸形胚率。对于试验中出现的类似根毛的胚状体，转入MS 培养基后只分化成根或少量的茎，均不能成苗，因此未列为胚状体进行统计分析。

出胚率/%=（出胚数/接种花药数）×100；成苗率/%=（成苗数/接种花药数）×100；畸形胚率/%=[（出胚数-成苗数）/出胚数]×100；根毛胚率/%=（根毛胚个数/接种花药数）×100。

1.3 数据分析

采用DPS（9.01）软件进行完全随机设计单因素试验方差分析。

2 结果与分析

2.1 品种对辣椒花药培养的影响

由表3 可知，在参试的15 个辣椒品种中有9个品种出胚，出胚率为0.37%～4.44%，7 个品种成苗，成苗率为0.56%～2.25%。不同品种的出胚率、成苗率、畸形胚率和根毛胚率有一定差异。在出胚率方面，短指椒品种中顺808 和PC447 最高，达4.44%；其与华之秀2 号（3.42%）和新时代（2.96%）差异不显著，但显著高于其他参试基因型的出胚率。博辣艳丽和无名线椒出胚率均为1.67%，豫园大椒F1和一品特大椒、美辣华之秀出胚率依次降低，而金螺三号、豫园巨椒、豫艺鲜辣128、黄线椒、贵州朝天椒和丰抗二号6 个品种未出胚。在成苗率方面，华之秀2 号成苗率最高，为2.25%，中顺808 和PC447 成苗率均为2.22%，3 个基因型之间成苗率差异不显著，与博辣艳丽（1.67%）和新时代（1.30%）的成苗率差异也不显著，但显著高于其他参试基因型的成苗率。豫园大椒F1和一品特大椒成苗率最低，均为0.56%。在畸形胚率方面，博辣艳丽和一品特大椒无畸形胚，全部成苗；华之秀2 号的畸形胚率为34.13%；中顺808、PC447 和豫园大椒F1的畸形胚率均为50.00%，新时代畸形胚率为55.56%，而无名线椒和美辣华之秀均为畸形胚。参试的15 个品种中9 个品种诱导出根毛胚，根毛胚率有一定差异，从高到低依次为一品特大椒、豫园大椒F1、新时代、豫园巨椒、华之秀2 号、豫艺鲜辣128、金螺三号、中顺808 和美辣华之秀，最高为3.33%，最低为0.37%。综上，参试的15 个品种中，华之秀2 号、中顺808、新时代、PC447 和博辣艳丽5 个品种成苗率较高，且这5 个品种在根毛胚率方面，除新时代较高（2.96%）外，其他4 个品种根毛胚率较低或无根毛胚。由此可知，这5 个品种花药培养效率最高。

表3 不同品种辣椒花药培养效率的比较

2.2 不同激素对辣椒花药培养的影响

由表4 可知，由不同种类及浓度的外源激素组成的3 种培养基对参试5 个辣椒品种花药培养效率的影响有一定差异。华之秀2 号在3 种培养基上的出胚率和根毛胚率差异均显著。在出胚率方面，3 种培养基出胚率表现为m3＆gt;m2＆gt;m1。在成苗率方面，m3成苗率最高，m3与m2培养基差异不显著，但二者均显著高于m1。m3出胚率、根毛胚率均显著高于m2，畸形胚率也高于m2，但根毛胚和畸形胚不能成苗。由此可知，m2培养基最适合华之秀2 号进行花药培养。中顺808 在3 种培养基上的成苗率和根毛胚率差异均不显著，m1出胚率和畸形胚率均与m3差异显著，但与m2差异不显著。m1出胚率和成苗率均最高，畸形胚率略低于m2，且3 种培养基上根毛胚率差异不显著。由此可知，m1培养基最适合中顺808 花药培养。新时代在3 种培养基上根毛胚率和畸形胚率差异均不显著。m1和m2出胚率均显著高于m3，但m1与m2差异不显著；m2成苗率高于m1和m3，且m2与m3差异显著，但与m1差异不显著；m2根毛胚率和畸形胚率均最低。由此可知，m2培养基最适合新时代花药培养。博辣艳丽在3种培养基上出胚率无显著差异，其中，m1出胚率最高，达2.22%，但成苗率为0.00%，均为畸形胚。m2出胚率虽略低于m1，但成苗率最高，为1.67%，且无畸形胚；3 种培养基上均无根毛胚萌发。由此可知，m2培养基最适合博辣艳丽花药培养。PC447 在3 种培养基上均无根毛胚萌发，m2出胚率和成苗率分别达4.44%、2.22%，均显著高于其他2 种培养基。由此可知，m2培养基最适合品种PC447 花药培养。综上分析，除中顺808 在m1上的辣椒花药效率较高以外，其他4 个品种均在m2上培养效果最好。由此可知，m2是辣椒花药培养时适用品种较广泛的培养基配方。

表4 不同激素组合对不同品种辣椒花药培养的影响

2.3 不同预处理时间对辣椒花药培养的影响

由表5 可以看出，将华之秀2 号分别进行1、2、3、4、5、6 和7 d 的4 ℃预处理后接种在m3培养基（出胚率较高）上，预处理时间为3 d 时，由于接种时人为操作不当造成全部污染，故不予统计。其余各处理出胚率、成苗率和根毛胚率均有一定差异，畸形胚率差异不显著。出胚率和成苗率均呈现出随预处理时间延长先升高后降低趋势。预处理2 d 时出胚率和成苗率均最高，分别为10.00%和6.67%，4 d 时出胚率和成苗率显著降低，当预处理7 d 时出胚率和成苗率均最低，分别为1.11%和0.56%。根毛胚率方面未发现与出胚率和成苗率相似规律，表明预处理时间长短不是根毛胚萌发的主要因素。综上所述，当花蕾经历2 d 的4 ℃预处理后，出胚率和成苗率均显著高于其他预处理时间，培养效果最好。

表5 不同预处理时间对出胚率、成苗率、畸形胚率和根毛胚率的影响

3 讨论与结论

笔者研究中参试的15 个不同类型辣椒品种有9 个出胚，出胚率0.37%～4.44%，7 个品种成苗，成苗率0.56%～2.25%。9 个出胚品种中5 个品种花药培养效率较高，表明品种是影响辣椒花药培养的重要因素。这与前人[10-11，13，22]的研究结论一致。另外，笔者研究中参试的4 个牛角椒品种3 个出胚，占比为75%，5 个线椒品种3 个出胚，占比60%；4 个短指椒品种2 个出胚，占比50%。表明不同类型辣椒花药培养诱导出胚概率不同，牛角椒品种较易出胚。这与前人的研究结果类似，戈伟等[18]研究表明牛角椒与辣椒杂种一代为较易出胚品种；赵激等[10]认为大果型品种比小果型品种较易出胚。

辣椒花药培养中激素种类及其配比一直是众多学者研究的内容。笔者的研究比较了2，4-D 与KT 组合（m2）、NAA 与KT 组合（m1）以及二者与KT 组合（m3）对辣椒花药培养的影响，结果表明，MS 培养基中添加1.0 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1KT（m2）是辣椒花药培养时适用品种较广泛的培养基配方。因此，笔者研究认为2，4-D 与KT 组合较NAA 与KT 组合更有助于辣椒花药培养胚状体诱导。这与刘独臣[24]的研究结论一致。但大多相关学者的研究集中在NAA 和KT 的研究[13，18-19]上，且认为NAA 比2，4-D 更适合辣椒花药培养。分析可能与不同研究中使用基本培养基不同和采用的激素浓度不同有关。已有前人研究[25]表明，在茄子花药培养方面，低浓度2，4-D 促进胚状体产生，高浓度2，4-D 促进愈伤组织产生。而在辣椒花药培养方面，前人[6，22，23]研究表明，0.005～0.100 mg·L-12，4-D与0.05～0.10 mg·L-1KT 组合有利于诱导辣椒花药产生胚状体。而笔者研究表明，高浓度2，4-D 和KT组合（1.0 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1KT）亦可广泛用于诱导辣椒花药产生胚状体。这在刘独臣[24]的研究中也有类似结论，且其研究表明，高浓度2，4-D 和KT 可促进出胚率较高的品种较快出胚，同时刺激在低浓度时不出胚的品种出胚。这表明高浓度的2，4-D 和KT 组合在不同作物的花药培养中效果不同。

花药接种前进行低温预处理能显著延长花药壁和花粉的退化时间，同时在花药壁中积累大量淀粉，为花粉的进一步发育提供营养[6]。笔者研究表明，4 ℃低温预处理2 d 时，花药培养效率最高，这与前人[13-14，26]的研究结论一致，但张天翔等[27]研究表明4 ℃低温预处理24 h 效果最好。有学者[6]认为4 ℃低温预处理3～5 d 对胚状体的形成有较好的促进作用，但也有研究者发现[5]，低温预处理对辣椒花药胚诱导无任何促进作用，这可能是由于各个研究的采蕾季节和花期不同。因此，针对不同季节的辣椒花药培养影响因素有待进一步研究。

笔者研究表明，品种是影响辣椒花药培养的重要因素；MS 培养基中添加1.0 mg·L-12，4-D、1.5 mg·L-1KT、4.0 mg·L-1AgNO3、3.0 g·L-1活性炭和30.0 g·L-1蔗糖较普遍适用于辣椒花药培养胚诱导；4 ℃低温预处理2 d 时最有利于辣椒花药培养。