miR-4505靶向SOX-10在先天性巨结肠中的作用及机制

吴凯 王健俊 何继贤 陈钦明 余岱岳 路羿 范凯斯 张梦真 杨六成

南方医科大学珠江医院小儿外科 （广州 510282）

先天性巨结肠（hirschsprung disease，HSCR）是一种常见的消化道畸形，发病率约为1/5 000 ～1/2 000，并有逐年增加的趋势，其发病机制尚未完全明确［1-2］。miRNA 是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20 ～ 25 个核苷酸，具有抑制靶mRNA 转录、翻译或者能够剪切靶mRNA，促进其降解，在发育过程中起着重要作用。miRNA 在HSCR 中同样具有重要的作用，如miR-145-3p［3］、miR-192-5p、miR-200a-3p［4］、miR-148a-3p［5］、miR-206［6］等均被证实与HSCR 的发生发展有着密切关系。前期我们采用微阵列miRNA 芯片检测发现miR-4505 在HSCR病变段肠管中高表达［3］，其在HSCR 中的具体作用仍不明确。本研究将进一步证实miR-4505 对细胞功能的影响，通过生物信息学及分子生物学实验阐明miR-4505 的作用分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料 收集自2018 年至2020 年期间在南方医科大学珠江医院行手术的HSCR 病变段肠管及扩张段肠管组织标本，分别采用液氮及甲醛保存，所有组织标本均经病理检查确认，标本采集均经过医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。人神经母细胞株SH-SY5Y 由中国科学院上海研究所细胞库提供。

1.1.2 主要试剂 miR-4505-mimics、miR-4505-inhibitors 及阴性对照（Negative control，NC）均为上海吉玛生物科技公司产品，LipolifectmineTM2000 购自美国Thermofisher 公司。自美国Invitrogen 公司购买Trizol RNA 提取试剂盒，miRNeasy 抽提试剂盒为德国Qiagen 公司产品，cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute miRNA 荧光定量试剂盒及相关引物购自北京天根生化科技有限公司（表1）。荧光素酶报告检测基因活性为美国Promega 公司产品，野生型及突变型SOX-10 质粒由广州锐博生物技术公司合成，CCK-8 为美国GLPbio 公司产品，SOX-10 一抗及羊抗兔二抗均为美国Abcam 公司产品。

表1 miR-4505qRT-PCR 的引物Tab.1 Sequences of primers for miR-4505

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转染 37 ℃水浴中复温，离心后加入5 mL 含10%FBS 的DMEM 培养基，接种于培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱内孵育。待细胞生长良好进行传代培养。

消化细胞，将终浓度20 pmol miR-4505mimics、miR-4505inhibitors、NC 溶于50 μL Opti-MEM 中，混匀，将1 μL lipo2000 溶于50 μL Opti-MEM 中，混匀，接种于96 孔板中完成下一步实验。

1.2.2 qRT-PCR 取细胞或研磨成粉末的组织标本，TRIzol 裂解细胞获取总RNA，随即使用RNasey Mini Kit 进行纯化，鉴定RNA 纯度，电泳方法检测RNA 完整性，总RNA 于-80℃冰箱内保存。随后采用SYBR Green I 荧光法检测miRNA，步骤如下：（1）取含有目的miRNA 总RNA 2 μg，给miRNA 的3'端加多聚PolyA 尾，Oligo（dT）-Universal Tag 进行反转录，合成对应的cDNA，采用的条件为37 ℃，60 min，随后95 ℃，5 min。（2）取miRNA 第一链的cDNA 液2 μL，加入miRNA qPCR Detection kit（SYBR Green），行荧光定量检测。反应条件：95 ℃10 min，1 个循环，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共45 个循环。以U6 为内参，计算miR-4505 的相对表达量。

1.2.3 CCK-8 检测细胞增殖 对数生长期细胞按每孔4 × 103细胞接种，加入100 μL 细胞培养液，分别将miR-4505 mimics，NC 或miR-4505inhibitors，随后加入LipolifectmainTM2000 转染，于0、24、48、72、96 h 显微镜观察细胞的生长情况，加入10 μL CCK-8，使用酶标仪检测各孔OD值，记录吸光度后绘制生长曲线。

1.2.4 Transwell法检测细胞迁移 转染细胞以1 ×104个/孔的密度置入专用24 孔板上孔，下层加入10%FBS培养基600 μL，上层加入100 μL的2%FBS完全培养基，37 ℃孵育72 h，随后吸弃上室培养液，4%多聚甲醛固定及0.5%结晶紫染色，显微镜下进行计数。

1.2.5 双荧光素酶报告系统验证miR-4505 的靶基因 使用miR-4505mimics、NC 及野生型、突变型SOX-10 质粒共转染细胞，转染后采用进行双荧光报告基因检测，48 h 后使用吸管吸去旧的培养液，加入报告基因细胞裂解液，将细胞刮离后转移至离心管内，高速离心，取裂解产物5 μL，加入100 μL 反应底物，检测荧光酶活性。随后再加入Stop&GloBReagent 100 μL，检测读取数值后计算相对表达量。

1.2.6 Western blot 裂解液裂解细胞后加入到EP管中，4 ℃ 12 000 r/min高速离心25 min，上清分装保存。取出5 μL蛋白，BCA法定量后加入蛋白上样缓冲液，配置浓缩胶及分离胶，加入到上样孔，电泳。48 V 电转50 min 将蛋白转移至PVDF 膜上，TBS 漂洗，封闭液振荡4 h，加入1∶1 000 的SOX-10 一抗，4 ℃过夜，漂洗后加入稀释的二抗，加入ECL工作液，显影和定影后采用凝胶成像系统处理蛋白条带。

1.2.7 免疫组化 取等量组织标本在60 ℃下烤片2 h 后进行脱蜡水化，使用蒸馏水冲洗，微波修复法修复抗原。随后加入过氧化氢及山羊抗血清进行封闭，加入SOX-10 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育1 h，DAB 显色后使用苏木素复染，二甲苯透明化处理后于显微镜下观察。阴性对照采用0.1 mol/L PBS 替代一抗。

1.3 统计学方法 使用Graphpad prism5.0 进行作图，SPSS19.0 进行统计分析，多个样本比较采用One-way ANOVE，CCK-8 的结果使用重复测量方差分析，两样本量之间比较采用独立样本t检验，两样本率的比较采用χ2检验，数据以均数±标准差表示，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSCR 病变段及扩张段肠管组织标本中miR-4505 的表达 HSCR 病变段肠管中miR-4505的相对表达量为6.187 ± 0.449，扩张段肠管的miR-4505 的相对表达量为0.937 ± 0.104，HSCR 病变段肠管的miR-4505相对表达量高于扩张段肠管，差异有统计学意义（t= 11.25，P= 0.000）。

2.2 qRT-PCR进一步验证转染后对人神经母细胞株的miR-4505 表达影响 PCR 结果采用one-way ANOVA 方差分析，转染后各组的miR-4505 表达量有明显差异，转染miR-4505 mimics 后SH-SY5Y 的miR-4505 的表达量（12.22 ± 1.146）较NC 组（1.00 ±0.036）增加，而转染miR-4505 inhibitors 后细胞的miR-4505 的表达量（0.196 ± 0.046）下降，差异均有统计学意义（P＜ 0.01）。

2.3 CCK-8 法检测miR-4505 对人神经母细胞株增殖的影响 各时间点的细胞增殖有差异（F时间=9.34，P＜ 0.001），各处理组的细胞增殖也有差异（F处理组= 79.00，P＜ 0.001），时间和组别有交互效应（F交互= 6.11，P= 0.002）。miR-4505 mimics 可使细胞的增殖能力减弱，这种趋势可随着时间延长而增强（P＜ 0.05），而miR-4505 inhibitors 可使细胞的增殖能力增强（P＜ 0.05）。见表2。

表2 CCK-8 检测miR-4505 对细胞增殖的影响Tab.2 The effect of miR-4505 on cell proliferation was detected by CCK-8±s

表2 CCK-8 检测miR-4505 对细胞增殖的影响Tab.2 The effect of miR-4505 on cell proliferation was detected by CCK-8±s

分组miR-4505 mimics NC miR-4505 inhibitors 0 h 0.282 ± 0.013 0.285 ± 0.015 0.285 ± 0.013 24 h 0.333 ± 0.029 0.345 ± 0.030 0.358 ± 0.026 48 h 0.385 ± 0.038 0.452 ± 0.039 0.489 ± 0.042 72 h 0.448 ± 0.042 0.548 ± 0.046 0.587 ± 0.051 96 h 0.490 ± 0.048 0.641 ± 0.052 0.712 ± 0.058

2.4 Transwell 检测miR-4505 对人神经母细胞株迁移的影响 Transwell 法检测发现上调miR-4505的表达后细胞的迁移至下孔的细胞数为16.00 ±2.280，而阴性对照组为48.20 ± 6.344，而抑制miR-4505 表达后迁移至下层的细胞数为68.00 ±4.940，miR-4505 可以抑制细胞迁移。采用oneway ANOVA 方差分析进行统计学处理：结果提示各处理组之间差异有统计学意义（F= 8.40，P=0.008）。见图1。

2.5 双荧光素酶报告基因证实miR-4505 与靶基因SOX-10 的作用关系 与突变型SOX-10 质粒相比，野生型SOX-10 质粒可以降低miR-4505 的表达（t= 11.19，P＜ 0.001）。见表3。

表3 双荧光素酶报告检测miR-4505 与SOX-10 的3'-UTR 的关系Tab.3 Relationship between miR-4505 and the 3'-UTR of SOX-10 was detected by dual luciferase reports ±s

表3 双荧光素酶报告检测miR-4505 与SOX-10 的3'-UTR 的关系Tab.3 Relationship between miR-4505 and the 3'-UTR of SOX-10 was detected by dual luciferase reports ±s

分组野生型SOX-10突变型SOX-10 miR-4505 mimics 0.214 ± 0.065 1.020 ± 0.082 NC 1.081 ± 0.102 1.142 ± 0.121

2.6 Western blot证实miR-4505可下调细胞SOX-10 的表达 上调细胞miR-4505 的表达后细胞的SOX-10 蛋白含量（0.298 ± 0.021）较阴性对照组（0.455 ± 0.025）降低，SOX-10 蛋白条带强度较浅，反之下调miR-4505 的表达后细胞的SOX-10 蛋白表达（0.559 ± 0.019）升高，SOX-10 蛋白条带增粗，条带灰度值经内参校正后采用one-way ANOVA方差分析进行统计学处理，结果显示各组差异有统计学意义（F= 76.23，P= 0.000 7）。见图2。

图2 Western blot 检测miR-4505 对细胞SOX-10 蛋白含量的影响Fig.2 The effect of miR-4505 on the SOX-10 protein was detected by Western blot

2.7 免疫组化证实SOX-10 在HSCR 狭窄段肠管中低表达 HSCR狭窄段肠管中仅有4例有SOX-10表达，均呈弱阳性（10.0%），而其余36 例HSCR 患者狭窄段肠管的SOX-10 表达为阴性（90.0%），而扩张段肠管SOX-10 表达均呈强阳性（100%），两组比较差异有统计学意义（χ2= 80.00，P＜ 0.001）。

3 讨论

肠神经系统发育异常被认为是导致HSCR 的主要原因，遗传因素及环境因素均可使胚胎发育过程中的肠神经母细胞增殖、迁移及分化能力下降，使得肠神经母细胞在肠管发育过程中质量及数量不能达到标准，远端肠管出现神经节细胞缺如，形成HSCR［7］。RET、GDNF、GFRa1、EDNRB、EDN3、SOX-l0、Sema3d、KIF26A、PHOX2B 等均被证实与HSCR 形成有关［8-11］。尽管有较多研究，当前对HSCR 的认识还不够充分，当前已知基因只能解释HSCR 中约50%的家系病例和20%的散发病例［12］。

miRNA 在生长发育过程中起着重要的作用。近年来，国内外也有很多研究证明miRNA 在HSCR形成过程中起着重要作用。如WANG 等［13］发现miR-195-5p 通过靶向GFRA4 抑制神经母细胞的增殖和侵袭，参与HSCR 形成。JI 等［14］发现miR-92a可以通过调节KLF4/PI3K/AKT 通路抑制细胞的活力和迁移能力而在HSCR 中发挥作用。前期我们采用基因芯片检测发现miR-4505 在HSCR 病变段肠管中高表达［3］。miR-4505在HSCR中的具体作用并不清楚，过往研究表明miR-4505在胃癌、口腔癌、焦虑症等多种疾病中均存在异常表达，其作为一个调控基因广泛参与细胞增殖、分化、迁移及凋亡的调控。LIN等［15］发现LCN-1可以抑制miR-4505调控CAIX影响口腔癌细胞增殖及迁移。ZHANG等［16］发现miR-4505可下调HSPA12B的表达，加重LPS诱导的血管内皮细胞损伤。KIM 等［17］证实miR-4505的表达与黏膜内胃癌淋巴结转移有着密切关系。我们的研究结果同样发现miR-4505 在HSCR 病变段肠管中高表达，过表达miR-4505 可抑制细胞增殖及迁移，而敲低miR-4505 可促进细胞增殖及迁移。miR-4505 是一个重要调节因子，在胚胎发育过程中可影响肠神经母细胞功能，参与HSCR形成。

miRNA 本身并不能编码蛋白，与靶基因的3'-UTR 结合抑制mRNA 翻译，降解mRNA 以及调控转录是其中非常重要的作用方式。细胞不同，miR-4505 可与不同的靶基因结合发挥不同作用。SOX-10 在外周神经系统发育中起着重要的作用，我们前期的研究表明SOX-10 在正常肠管肌间神经丛的神经元及胶质神经细胞中均有表达，而在HSCR 无神经节肠管呈一致性降低［18］。通过敲除小鼠SOX-10 的等位基因将导致小鼠结肠末端神经节细胞缺陷症［19］。而基因分析表明，在SOX-10结合位点中存在EDNRB 的结合区，SOX-10 可以调控RET 基因的表达，进而影响外周神经元的增殖、分化及迁移［20］。因此，SOX-10 是肠神经系统发育中的重要上游调控因子，SOX-10 异常是导致HSCR 形成的重要原因。本研究利用TargetScan 及miRBase 预测miR-4505 的靶基因，初步确定SOX-10 作为miR-4505 的潜在靶基因。随后采用双荧光素酶报告基因实验证实miR-4505 可以与SOX-10 的3'-UTR 结合影响SOX-10 的表达。而在组织标本中我们同样发现SOX-10 在HSCR 病变段肠管中低表达，进一步证实miR-4505 在HSCR 中发挥作用可能与抑制SOX-10 表达有关。

综上所述，我们的研究表明miR-4505 与HSCR发病密切相关，其发挥作用可以与调控SOX-10 的表达影响神经母细胞增殖及迁移，导致肠神经系统发育障碍有关。本研究为HSCR 的诊治提供了新思路。本研究仍存在局限性，miR-4505 对肠神经干细胞确切作用以及在体内具体的作用机制仍有待进一步研究。

【Author contributions】WU Kai designed experiment and wrote the article.WANG Jianjun，CHEN Qinming，HE Jixian，YU Daiyue，LU Yi performed the experiments and collected data.ZHANG Mengzhen，FAN Kaisi completed statistics.YANG Liucheng guided the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.