黄韧带中成纤维细胞生长因子1、血管内皮生长因子表达与腰椎管狭窄患者腰椎减压术后再狭窄的关系

陈耀鑫 黎松波 方冠军 叶国标 刘先银

南方医科大学附属东莞医院骨科（广东东莞 523000）

腰椎管狭窄（LSS）是一种与年龄相关的脊柱退行性疾病［1-2］，经皮椎间孔镜手术与显微内镜手术能完整保留腰椎生理结构且创伤小，在LSS 治疗方面有显著优势［3］。但椎管减压术后不可避免发生再狭窄、LSS 复发和邻近节段疾病［4］，术后再狭窄增加再次翻修手术概率，寻找再狭窄的因素和标志物有助于手术治疗策略调整以及术后预防。研究显示黄韧带受变性和轴向压迫影响发生纤维化、肥厚和骨化是引起LSS 的主要原因，椎间盘软骨中蛋白多糖过多引起的炎症反应在黄韧带纤维化等一系列病理改变中发挥关键作用［5］。成纤维细胞生长因子1（FGF-1）可通过抑制转化生长因子（TGF）-β1 信号通路恢复上皮-间质转化，抑制成纤维细胞胶原蛋白产生和向肌成纤维细胞分化，缓解纤维化进程［6］。血管内皮生长因子（VEGF）是一种有效的血管生成因子，在炎症反应中VEGF 作为单核细胞的强效趋化剂，诱导单核细胞浸润和释放炎症细胞因子，增加血管通透性和炎性损伤［7］。然而FGF-1、VEGF 在LSS 的相关报道十分少见，如果能证实FGF-1、VEGF 与LSS的关系可能为临床治疗提供新的靶点，同时有助于临床预防，完善治疗方案。鉴于此，本研究拟检测手术切除的黄韧带组织中FGF-1、VEGF 表达，分析其与LSS 病情以及腰椎减压术后再狭窄的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018 年1 月至2022 年1 月在南方医科大学附属东莞医院骨科收治的138 例行腰椎减压术治疗的LSS 患者（LSS 组），男85 例，女53 例，年龄49 ～ 63 岁，平均（54.89 ± 7.42）岁，手术部位：L3-427 例，L4-594 例，L5-S117 例。纳入标准：（1）腰椎CT、MRI 片显示椎管容积明显减小，经临床诊断为LSS；（2）椎间盘镜下腰椎减压术和内固定融合治疗；（3）本地常驻居民，能配合随访者。排除标准：（1）腰椎严重不稳或存在多节段病变；（2）血管跛行、脊柱翻修手术、假性关节病、先天性脊柱畸形；（3）腰椎创伤、肿瘤、感染。采用绝对跛行距离（ACD）进行椎管狭窄程度分级［8］，根据椎管狭窄程度分级将LSS 患者分为轻度组（1-2 级，ACD ≤ 200 m，41 例）、中度组（3-4 级，ACD 201 ～ 400 m，67例）和重度组（5-6级，ACD ＞ 400 m，30 例）［8］。另选择同期我院骨科收治的138 例行腰椎手术治疗的非LSS 患者为对照组，男89 例，女49 例，年龄50 ～ 65 岁，平均（55.10 ± 7.19）岁，手术部位：L3-428例，L4-593例，L5-S117例。两组性别、年龄、手术部位比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。本研究已经获得南方医科大学附属东莞医院伦理委员会批准，患者及其家属均知情同意签署同意书。

1.2 黄韧带中FGF-1、VEGF表达检测 采用实时定量聚合酶链式反应（qPCR）法检测黄韧带中FGF-1、VEGF 表达：取手术切除的黄韧带，Trizol 法（美国Thermo Fisher公司）提取组织总RNA，取1 mg总RNA，使用cDNA Synthesis kit（日本TaKaRa 公司）将其反向转录成cDNA。取2 μL cDNA 样品加入qRT-PCR 体系，MyiQ2 双色实时PCR 检测系统（美国Bio-Rad 公司）进行qPCR 反应。以β-actin 为内参，2-ΔΔCt计算FGF-1、VEGF 相对表达量。

1.3 免疫组织化学法黄韧带中FGF-1、VEGF 蛋白表达检测 取黄韧带组织石蜡包埋切片，经40 ℃温水浸泡5 min，37 ℃恒温箱烘干，无水乙醇梯度脱蜡。抗原修复和血清封闭后加入一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗，37 ℃温箱孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3 次，37 ℃温箱孵育30 min。光学显微镜下观察，以磷酸盐缓冲液代替一抗为阴性对照，细胞质黄染或棕染为阳性。

1.4 术后随访 所有患者出院后均定期接受电话随访和门诊复查腰椎MRI，随访时间截止2022年12 月，统计术后再狭窄的发生情况，术后再狭窄指原发病灶再次发生狭窄。收集患者性别、年龄、体质量指数、吸烟史、饮酒史、基础疾病、LSS病程、临床症状、LSS 侧别、手术部位、手术时间、术后第6 个月以及术后1 年的Oswestry 残疾指数（ODI）［9］和腰痛和下肢痛视觉模拟量表（VAS）评分［10］、减压不彻底（术后MRI 复查提示腰椎存在突出物残留）、邻近节段病变、术后并发症。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.00 录入和分析数据，连续性变量均符合正态分布以（±s）表示，采用单因素方差分析（两两对比采用LSD-t检验）或独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。多因素logistic 回归分析LSS 患者腰椎减压术后再狭窄的危险因素。检验水准α = 0.05，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LSS 组和对照组黄韧带组织中FGF-1、VEGF表达比较 免疫组化检测结果显示LSS 组黄韧带组织中FGF-1 蛋白阳性表达率为20.29%（28/138），低于对照组的56.52%（78/138）（χ2= 38.291，P＜ 0.001），VEGF 蛋白阳性表达率为68.12%（94/138），高于对照组的23.91%（33/138）（χ2= 54.272，P＜ 0.001）。qPCR 检测结果显示LSS 组黄韧带组织中FGF-1 表达低于对照组（P＜ 0.001），VEGF 表达高于对照组（P＜ 0.001）。见表1。

表1 LSS 组和对照组黄韧带组织中FGF-1、VEGF 表达比较Tab.1 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS group and control group±s

表1 LSS 组和对照组黄韧带组织中FGF-1、VEGF 表达比较Tab.1 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS group and control group±s

组别LSS组对照组t值P值例数138 138 FGF-1 2.03 ± 0.42 5.39 ± 1.57-24.287＜ 0.001 VEGF 7.02 ± 1.95 4.18 ± 1.27 14.336＜ 0.001

2.2 不同椎管狭窄程度LSS 患者黄韧带组织中FGF-1、VEGF 表达比较 重度组黄韧带组织中FGF-1 表达低于中度组和低度组（P＜ 0.05），且中度组低于低度组（P＜ 0.05），重度组黄韧带组织中VEGF 表达高于中度组和低度组（P＜ 0.05），且中度组高于低度组（P＜ 0.05）。见表2。

表2 不同椎管狭窄程度LSS 患者黄韧带组织中FGF-1、VEGF 表达比较Tab.2 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS patients with different degree of spinal stenosis ±s

表2 不同椎管狭窄程度LSS 患者黄韧带组织中FGF-1、VEGF 表达比较Tab.2 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS patients with different degree of spinal stenosis ±s

注：与轻度组比较，aP ＜ 0.05；与中度组比较，bP ＜ 0.05

组别轻度组中度组重度组F值P值VEGF 6.22 ± 0.16 7.02 ± 1.21a 8.11 ± 0.36ab 41.189＜ 0.001例数41 67 30 FGF-1 2.20 ± 0.21 2.05 ± 0.36a 1.75 ± 0.13ab 22.257＜ 0.001

2.3 LSS 患者腰椎减压术后再狭窄的因素分析 中位随访23 个月，失访2 例，发生再狭窄48 例。再狭窄组年龄大于无再狭窄组（P＜ 0.001），男性、吸烟史、糖尿病、LSS 椎管重度狭窄、减压不彻底、邻近节段病变比例高于无再狭窄组（P＜ 0.05，P＜ 0.001），LSS 病程长于无再狭窄组（P＜ 0.001），术后6 个月ODI 评分、术后1 年ODI 评分、术后6 个月腰痛VAS 评分、术后1 年腰痛VAS 评分、VEGF表达高于无再狭窄组（P＜ 0.001），FGF-1 表达低于无再狭窄组（P＜ 0.001），两组其他资料比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表3。

表3 影响LSS 患者腰椎减压术后再狭窄的因素分析Tab.3 Analysis of factors affecting restenosis after lumbar decompression in LSS patients±s

表3 影响LSS 患者腰椎减压术后再狭窄的因素分析Tab.3 Analysis of factors affecting restenosis after lumbar decompression in LSS patients±s

项目t/χ2值P值年龄（岁）性别［例（%）］男女体质量指数（kg/m2）吸烟史［例（%）］饮酒史［例（%）］基础疾病［例（%）］高血压糖尿病高脂血症LSS病程（个月）临床症状［例（%）］腰痛下肢痛间歇性跛行下肢肌力减退LSS侧别［例（%）］单侧双侧LSS椎管狭窄程度分级［例（%）］轻中度重度手术部位［例（%）］再狭窄组（n = 48）58.32 ± 6.02无再狭窄组（n = 88）53.02 ± 5.09 5.433 4.407＜ 0.001 0.036 35（72.92）13（27.08）23.12 ± 0.69 30（62.50）21（43.75）48（54.55）40（45.45）23.05 ± 0.51 36（40.91）30（34.09）0.673 5.797 1.236 0.502 0.016 0.266 23（47.92）30（62.50）19（39.58）10.21 ± 2.03 32（36.36）29（32.95）26（29.55）7.12 ± 1.69 1.721 11.038 1.434 9.480 0.190 0.001 0.235＜ 0.001 42（87.50）40（83.33）21（43.75）10（20.83）80（90.91）79（89.77）33（37.50）16（18.18）0.391 1.178 0.507 0.141 1.288 0.532 0.278 0.477 0.707 0.256 31（64.58）17（35.42）65（73.86）23（26.14）20.301＜ 0.001 27（56.25）21（43.75）79（89.77）9（10.23）0.213 0.899 L3-4 L4-5 L5-S1术后6个月ODI评分（分）术后1年ODI评分（分）术后6个月腰痛VAS 评分（分）术后1年腰痛VAS 评分（分）术后6个月下肢痛VAS 评分（分）术后1年下肢痛VAS 评分（分）减压不彻底［例（%）］邻近节段病变［例（%）］术后并发症［例（%）］切口感染脑脊液漏FGF-1 VEGF 10（20.83）32（66.67）6（12.50）29.35 ± 6.09 17.21 ± 2.02 3.02 ± 0.95 2.05 ± 0.47 2.11 ± 0.69 1.67 ± 0.42 12（25.00）11（22.92）16（18.18）62（70.45）10（11.36）15.21 ± 3.02 11.32 ± 2.65 2.11 ± 0.69 1.25 ± 0.32 2.05 ± 0.43 1.60 ± 0.41 9（10.23）8（9.09）18.112 13.411 6.412 11.751 0.624 0.943 5.191 4.940＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001 0.534 0.347 0.023 0.026 4（8.33）2（4.17）1.85 ± 0.26 8.10 ± 0.33 6（6.82）1（1.14）2.17 ± 0.36 6.59 ± 0.37 0.150 0.291-5.430 23.607 0.699 0.590＜ 0.001＜ 0.001

2.4 影响LSS 患者腰椎减压术后再狭窄的logistic回归分析 多因素logistic 回归方程，向后逐步法排除无关变量，最终LSS 椎管重度狭窄、减压不彻底、高表达VEGF 是LSS 患者腰椎减压术后再狭窄危险因素（P＜ 0.05，P＜ 0.001），FGF-1 是保护因素（P＜ 0.05）。见表4。

表4 影响LSS 患者腰椎减压术后再狭窄的多因素logistic 回归方程Tab.4 Multivariate Logistic regression equation affecting restenosis of lumbar spine after decompression in LSS patients

3 讨论

本研究首次证实LSS黄韧带组织中FGF-1表达下调，FGF-1 蛋白阳性表达率降低，VEGF 表达明显上调，VEGF 蛋白阳性表达率升高，随着椎管狭窄程度增加FGF-1表达降低，VEGF表达升高，回归分析结果证实高表达VEGF是LSS患者腰椎减压术后再狭窄危险因素，FGF-1是保护因素，提示FGF-1表达缺失、VEGF 过表达可能促使黄韧带肥厚，与LSS腰椎椎管狭窄程度加重以及术后再狭窄有关。

椎管减压术后因减压不足、术前腰椎不稳定、邻近节段腰椎退变等因素导致再狭窄和LSS 复发［11］。研究显示［12］LSS患者椎管减压融合术后病灶复发率达48.8%。再次手术率为（11.22 ± 4.25）%［13］。若LSS 复发再次接受手术治疗术后疼痛和腰椎功能改善程度明显差于首次手术［14］。黄韧带细胞及其周围组织分泌的多种细胞因子和生长因子在黄韧带纤维化激活中发挥不可替代的作用［15］。FGF-1具有抗炎和抗纤维化作用，通过促进TGF-β 受体1降解，减弱TGF-β1 下游Smad 信号通路，抑制肌成纤维细胞分化，减弱肝脏［16］和肺［7］的纤维化。FGF-1 还可抑制核因子-κB 和c-Jun N 端激酶信号通路抑制炎症反应，降低炎性损伤［17］。本研究发现FGF-1 表达缺失与LSS 腰椎椎管狭窄程度加重以及术后再狭窄有关，推测可能的机制为：机械拉伸作用下黄韧带组织中白细胞介素（IL）-6 表达促使黄韧带组织炎症，诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变，导致黄韧带纤维化和肥大［18］，而FGF-1 可下调IL-6、IL-8、环氧化酶2/前列腺素E2的表达，限制机械力诱导的炎症反应，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变［19］，缓解纤维化进程。

本研究发现VEGF 过表达可能促使黄韧带肥厚，VEGF 可能是腰椎管狭窄症的发病机制之一。HUR 等［20］报道也显示LSS 患者外周血VEGF 水平较非LSS 对照组显著增高，且与黄韧带厚度呈正相关，LAKEMEIER 等［21］研究也显示黄韧带组织中VEGF 表达增高与MRI 测量的椎间盘黄韧带横截断面积增大有关。分析原因为机械应激和炎症反应刺激下，VEGF 表达上调，介导血管新生增加和黄韧带肥大和纤维化，进而导致腰椎椎管狭窄［20］。VEGF 及其受体VEGFR-1 和VEGFR-2 在椎间盘细胞产生的IL-1、肿瘤坏死因子-α 诱导下表达上调，有助于LSS 机械应激引起的肥大黄韧带中血管生成［22］，进而加剧椎管狭窄程度。

本研究局限性在于样本例数偏少，可能存在统计学偏倚，其次为单中心研究，可能样本不具有普遍性，难以直接证实FGF-1、VEGF 与椎间管狭窄程度的关系，仍需扩大样本例数，开展大样本、多中心临床研究以及基础研究加以证实。

综上所述，检测黄韧带组织中FGF-1、VEGF表达有助于了解黄韧带病变情况，评估术后再狭窄风险。FGF-1、VEGF 有望作为LSS 治疗的潜在靶点。

【Author contributions】CHEN Yaoxin： Design a research plan，implement the research process，and write a paper.LI Songbo，LIU Xianyin： Propose research ideas，analyze experimental data，and review papers； YE Guobiao，FANG Guanjun： Implementing the research process，collecting and organizing data，and revising papers； Conduct statistical analysis.