刺五加多糖对骨肉瘤小鼠抑瘤作用及免疫功能的影响

李东光,于 波,李笑莹,曹 静,王 禹

(佳木斯市中医医院,黑龙江 佳木斯 154002)

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,多发于青少年,发病率高峰对应于骨骼快速生长期[1]。随着外科手术和各种化疗方案的发展和进步,骨肉瘤的五年总生存率有了显著提高,但依然存在预后较差的问题[2],因此迫切需要探究骨肉瘤发展的潜在机制,以开发更有效的骨肉瘤治疗方法。从病理学角度分析,大多数肿瘤患者的免疫系统低下,免疫细胞活性被抑制,促进了肿瘤细胞生长,因此研究改善其免疫系统的药物有利于抑制肿瘤生长[3]。骨肉瘤在中医学中可归属“癌病”范畴,现代医家认为其病因病机多与“虚、寒、痰、瘀、毒”有关,此外,邪毒与骨肉瘤的发病也密切相关,中医药治疗骨肉瘤能够起到增效减毒,培补正气之功效。中药以其独特的治疗优势,通过多种生物活性成分、多通路、多靶点的途径,可提高肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性[4-5]。中药有效成分通过相关信号通路干预骨肉瘤转移已成为研究热点,通过抑制骨肉瘤转移相关的STAT3、PI3K/Akt、NF-κB、MAPKs、Wnt/β-Catenin多种信号通路活性,在抑制骨肉瘤细胞转移中发挥了重要的作用。刺五加是一种应用广泛的中药材,明代李时珍《本草纲目》记载其辛、微苦,温,归脾、肾、心经;《中国药典》记载其具有健脾益气、补肾安神的功效。近年来的研究证明,刺五加的活性成分对多种癌细胞类型表现出细胞毒性作用。刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide,ASPS)主要由水溶性多糖与碱溶性多糖组成,对机体的免疫功能具有重要调节作用。研究指出,ASPS能够调节小鼠耳、足趾肿胀等模型小鼠血清中IL-6和TNF-α水平,参与免疫功能调节[6]。同时研究还发现ASPS可明显抑制人非小细胞肺癌细胞株NCI-H520的增殖和转移能力[7],但ASPS对骨肉瘤的研究鲜有报道。本研究旨在探讨ASPS对骨肉瘤小鼠的抑瘤作用及免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 5周大的清洁级BALB/c小鼠(18～22 g),购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(豫)2020-0005,动物适应性喂养1周,期间随意提供标准的食物和水,饲养环境为温度23～25 ℃,湿度为50%～60%,12 h明/暗交替,该研究已获得动物护理和使用委员会的批准。

1.2 实验细胞 美国ATCC公司提供人成骨肉瘤MG63细胞株,将细胞与含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5%二氧化碳恒温箱中孵育,2 d更换1次培养基,待细胞融合至90%后,经消化、离心后用于构建骨肉瘤小鼠模型。

1.3 实验试剂和仪器 西安小草植物科技有限公司提供ASPS;江苏豪森药业股份有限公司提供顺铂;美国R&D公司提供白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒;上海碧云天公司提供RIPA裂解缓冲液;北京博奥森生物工程有限公司提供HE试剂盒;Milipore公司提供化学发光检测试剂盒;Abcam公司提供CD4+、CD8+、程序性死亡因子1(PD-1)及配体(PD-L1)单克隆抗体。赛默飞世尔科技公司提供Attune NxT流式细胞仪;北京普天新桥技术有限公司提供PTW-1000多功能全自动酶标仪。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠骨肉瘤模型的构建及干预:将适应1周的小鼠,通过前肢后内侧注射100 μl肿瘤细胞悬液(5×106个/ml)制备骨肉瘤小鼠模型,当小鼠长出皮下肿瘤直径约1 cm,标记为成功造模[8],共50只小鼠建模成功,随机分为模型组、刺五加多糖低、中、高剂量组、顺铂组,并以正常小鼠为对照组,每组10只;刺五加多糖低剂量组、刺五加多糖中剂量组、刺五加多糖高剂量组分别给予36.25、72.5、145 mg/kg ASPS灌胃干预,并给予腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液[9];顺铂组给予腹腔注射25 mg/kg顺铂,并给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃[10];模型组和对照组灌胃并腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液,每日1次,连续2周。

1.4.2 ELISA检测血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平:末次给药结束后,麻醉并处死小鼠,经眼球取血,离心后收集血清,按照试剂盒要求检测血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平。

1.4.3 流式细胞仪检测CD4+、CD8+细胞比例:经腹部主动脉取血,在37 ℃下在消化缓冲液(2.5 mg/ml胶原酶Ⅱ、2.5 mg/ml胶原酶Ⅳ和0.5 mg/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ)中孵育13～15 min,按照密度梯度离心法提取淋巴细胞分离液,以氩离子为光源,488 nm为激光波长,采用流式细胞仪分析CD4+、CD8+细胞比例。

1.4.4 瘤体重量及抑瘤率计算:分离各组肿瘤组织,利用电子天平称取瘤体重量并计算抑瘤率。

1.4.5 胸腺指数和脾脏指数:摘取小鼠脾脏和胸腺,称重后计算脾脏及胸腺指数,脾脏(胸腺)指数=脾脏(胸腺)重量(mg)/体重(g)×10。

1.4.6 HE检测肿瘤组织病理学变化:将部分肿瘤组织经固定、石蜡包埋后制备石蜡切片,行苏木精、伊红染色,显微镜下观察病理变化。

1.4.7 Western blot检测肿瘤组织PD-1、PD-L1蛋白表达:RIPA裂解液提取肿瘤组织总蛋白,SDS-PAGE分离等量蛋白质并转移到PVDF膜,将膜封闭后,与PD-1、PD-L1一抗体在4 ℃下免疫印迹过夜,在通过使用化学发光检测试剂盒可视化之前,将膜在室温下与二抗孵育1 h,采用Image J软件分析条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平比较 见表1。与对照组相比,模型组IL-2、IFN-γ、TNF-α水平均显著增加(P<0.05);与模型组相比,刺五加多糖低、中、高剂量组IL-2、IFN-γ、TNF-α水平均显著降低,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),但顺铂组与刺五加多糖高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平比较

2.2 各组小鼠外周血中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比较 见表2。与对照组相比,模型组小鼠外周血中CD8+显著增加,CD4+及CD4+/CD8+显著降低(P<0.05);与模型组相比,刺五加多糖低、中、高剂量组小鼠外周血中CD8+显著降低,CD4+及CD4+/CD8+显著增加,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),但顺铂组与刺五加多糖高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组小鼠外周血中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比较

2.3 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较 见表3。与对照组相比,模型组瘤体重量显著增加(P<0.05);与模型组相比,刺五加多糖低、中、高剂量组瘤体重量显著降低,抑瘤率显著增加,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),但顺铂组与刺五加多糖高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较

2.4 各组小鼠胸腺和脾脏指数比较 见表4。与对照组相比,模型组脾脏指数、胸腺指数显著降低(P<0.05);与模型组相比,刺五加多糖低、中、高剂量组胸腺指数、脾脏指数显著增加,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),但顺铂组与刺五加多糖高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 各组小鼠肿瘤组织病理学变化 模型组肿瘤细胞排列紧密,细胞核较大,核膜完整;刺五加多糖低、中、高剂量组、顺铂组干预后,细胞染色逐渐变浅,部分细胞核分裂,肿瘤细胞减少,其中以刺五加多糖高剂量组、顺铂组变化较为明显(图1)。

2.6 各组小鼠肿瘤组织PD-1、PD-L1蛋白表达比较 见表5(图2)。与对照组相比,模型组PD-1、PD-L1蛋白表达显著增加(P<0.05);与模型组相比,刺五加多糖低、中、高剂量组PD-1、PD-L1蛋白表达显著降低,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),但顺铂组与刺五加多糖高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

··A:对照组;B:模型组;C:刺五加多糖低剂量组;D:刺五加多糖中剂量组;E:刺五加多糖高剂量组;F:顺铂组

表5 各组小鼠肿瘤组织PD-1、PD-L1蛋白表达比较

3 讨 论

骨肉瘤是一种罕见的恶性肿瘤,主要影响儿童和青少年,化疗是目前治疗骨肉瘤患者的主要方式,但该疾病的恶性程度及病死率依然较高,严重影响患者生存期[11-12]。同时研究发现传统化疗可加重中晚期骨肉瘤患者免疫功能紊乱,不利于改善疾病症状,因此需要研究新的方案治疗骨肉瘤[13]。中医药治疗骨肉瘤已成为众多学者研究的热点,可提高骨肉瘤患者生存期,降低骨肉瘤病死率,减少化疗药物的不良反应,增效减毒,在骨肉瘤的治疗中具有广阔的应用前景。

骨肉瘤在中医归为“瘿瘤、骨瘤、脂瘤、石瘤”等,《备急千金要方》中首次提到“骨瘤”“肉瘤”的病名,《普济方》中提到:“气血流行,不失其常……瘤所以生”。骨肉瘤发生的重要病因病机与气血不和密切相关。刺五加具有补气血、健脾养胃、活血化瘀等作用。现代药理研究显示,刺五加及其活性成分不仅具有免疫刺激作用,还具有抗肿瘤作用。刺五加多糖是五加科植物中的有效成分,主要由水溶性多糖和碱溶性多糖组成,具有抗肿瘤、免疫调节、降低血糖以及抗氧化等多种生物学活性,其作用机制可能与免疫功能有关,如肿瘤生长过程中,ASPS通过提高淋巴细胞增殖以及T细胞杀伤活性等抑制肿瘤生长[14]。如ASPS可以通过影响PD-L1及凋亡因子的表达抑制喉癌干细胞的增殖[15]。在肿瘤免疫反应的过程中,脾脏是免疫反应的启动部位,而胸腺是T淋巴细胞分化的重要组织器官,两者均在其中发挥重要作用[16]。此外,细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等以及CD4+分子和CD8+分子可通过调节免疫功能在免疫应答中起着非常关键的作用,CD4+/CD8+比值变化可反映机体免疫状态[17]。本研究发现骨肉瘤小鼠中肿瘤细胞排列紧密,小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平、外周血中CD8+显著增加,脾脏指数、胸腺指数、CD4+及CD4+/CD8+显著降低,表明骨肉瘤小鼠免疫功能降低,促进了肿瘤生长。当ASPS干预后,降低了小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平、外周血中CD8+比例以及瘤体重量,提高了脾脏指数、胸腺指数、CD4+及CD4+/CD8+细胞比例,表明ASPS可抑制肿瘤生长,改善肿瘤微环境,提高小鼠免疫功能。

肿瘤免疫治疗中,对肿瘤微环境中T细胞或其受体的靶向治疗逐渐被研究者们所重视,并已在不同肿瘤治疗中,取得了较为理想的疗效[18-19]。PD-1/PD-L1是肿瘤免疫抑制的重要组成部分,被认为是免疫治疗研究中的关键[20]。既往研究显示,PD-1/PD-L1过表达与患者肿瘤转移和肿瘤病死率成正相关[21],此外,PD-1、PD-L1可介导免疫逃逸[22]。当ASPS干预后,肿瘤组织中PD-1、PD-L1蛋白表达显著降低,提示ASPS可能抑制PD-1/PD-L1实现肿瘤生长抑制以及免疫功能的改善[23-25]。

综上所述,ASPS可抑制骨肉瘤小鼠肿瘤生长,改善小鼠免疫功能,可能与PD-1/PD-L1信号通路改变有关,为临床骨肉瘤药物治疗提供理论支持,但其作用机制还有待完善。