针灸预处理调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抗大鼠胃黏膜损伤机制研究

兰永利,周知然,韦 芳,霍新慧

(1.新疆医科大学中医学院,新疆 乌鲁木齐830001;2.新疆维吾尔自治区中医医院,新疆 乌鲁木齐830001)

随着人们生活方式的变化,酒精的长期饮用逐渐成为刺激胃肠组织器官正常生理结构的主要因素之一,其中胃黏膜的损伤就是酒精刺激直接引起的组织损伤[1]。胃黏膜损伤主要为黏膜组织的充血、水肿、糜烂、溃疡,病变较重时侵及黏膜,发生上消化道出血[2]。有研究显示,炎症反应在胃黏膜组织病变中担任着关键的角色[3],炎症反应是机体应对有害刺激而促进修复的自我防御措施,然而当炎性因子分泌过多时,会使原本的稳态环境被打破,导致疾病的进一步恶化发展。

针灸作为中医学的重要组成部分,在经络辨证的指导下,在疾病防治方面具有实用价值[4-5]。特别是灸法,以其特有的绿色疗法和简便性的特点,在临床认可度比较高。本课题组前期研究表明[6],针灸预处理能够加强胃黏膜微循环屏障,上调与屏障相关的保护因子,下调损伤因子,达到对胃黏膜组织的保护作用。

Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路主要是与炎性因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-β(IL-β)等的释放有关,在炎症反应的发生发展中起着关键性的作用[7]。此研究是基于对大鼠胃黏膜中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平的观察,进一步探究针灸对胃黏膜“治未病”的作用机制,为应用于临床预防提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级,雌雄各半SD大鼠52只,体重(180±20)g,新疆医科大学动物实验中心购得,动物合格证号:SYXK(新)2018-0003,由新疆医科大学动物实验中心喂养。大鼠自由摄食、摄水,饲养室温度:20～25 ℃,相对湿度:50%～54%,自然昼夜交替。在实验开始前适应性饲养7 d后进行实验,实验全程动物处理遵照本校动物实验中心伦理委员会要求进行。

1.2 药物与试剂 无水乙醇(天津市凯通化学试剂有限公司),阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司,国药准字J20130078),大鼠TNF-α ELISA试剂盒(上海优选生物科技有限公司,批号:YX-E21174);大鼠IL-1β ELISA试剂盒(上海优选生物科技有限公司,批号:YX-E20958)。

1.3 实验仪器 实验用一次性针灸针(华佗牌,规格0.25 mm×13 mm),艾灸条(南阳汉医艾绒有限责任公司,规格4 mm×120 mm),固定支架(蕲春上工记艾灸器具开发有限公司),酶标分析仪(型号:Infinite F50,上海优选生物科技有限公司),高速冷冻离心机(德国,型号:Eppendorf 5415C),分光光度计(日本,型号:SHIMAZDU UV-2540),蛋白印迹仪(台湾威泰克有限公司,型号: Yrdimes SW07D0567),台式恒温振荡器(中国上海精宏实验设备有限公司,型号:THZ-312),凝胶成像分析系统(台湾威泰克有限公司,型号:KETAM多用凝胶成像系统)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与干预方式:采用数字编号法对大鼠进行标号,而后按照随机数字表法将其分为正常组、模型组、预灸组、针预组,每组13只。在适应性饲养7 d之后,每日上午10:00开始进行针灸预处理的干预操作。

腧穴的取穴依据《实验针灸学》常用动物穴位定位法进行确定[8]。中脘穴位于脐上约 20 mm;足三里穴位于膝关节后外侧,在腓骨小头下约3 mm处。

正常组:艾灸支架固定,20 min/次,不做处理,1次/d,连续7 d;模型组:艾灸支架固定,20 min/次,不做处理,1次/d,连续7 d;预灸组:艾灸支架固定,温和灸悬灸中脘、足三里(双),20 min/次,1次/d,持续7 d;针预组:艾灸支架固定,一次性针灸毫针针刺中脘、足三里(双),平补平泻,20 min/次,1次/d,持续7 d;每次处理结束之后,解除大鼠支架固定,回饲养室进行正常喂养,连续预处理7 d。

1.4.2 造模:在预处理7 d结束之后,第8天禁食不禁水,第9天开始对模型组、预灸组、针预组进行胃黏膜损伤模型的制备。应用动物实验室常用灌胃手法,采用无水乙醇与阿司匹林混悬液法建立模型,阿司匹林肠溶片与0.9%氯化钠溶液(2000 mg∶100 ml)配制成阿司匹林混悬液,先用无水乙醇0.6 ml/100 g进行灌胃,1 h后再予以阿司匹林混悬液200 mg/kg进行灌胃造模,造模4 d。

1.5 观察指标

1.5.1 血清及胃黏膜组织采集:第1天造模结束后,当天22:00禁食禁水,第13天上午10:00开始取材。采用10%水合氯醛麻醉,起效后,腹主动脉取血,使用离心机离心后取上层血清,解剖将全胃取出,沿胃大弯剪开,用0.9%氯化钠溶液冲洗干净,充分暴露胃黏膜组织,拍照观察胃黏膜损伤情况,评定胃黏膜损伤指数(UI),后分成两部分,一部分在4%多聚甲醛中固定,用于指标检测,另一部分储存于-80 ℃液氮中。

1.5.2 一般情况及体重:对大鼠摄水摄食、毛发、大便、活动度,精神、体重等一般情况进行观察[9],体重每4 d测量1次。

1.5.3 评定胃黏膜损伤指数(UI):采用GUTH[10]法进行计算。将胃黏膜组织应用0.9%氯化钠溶液冲洗干净,然后平铺于滤纸上,在10倍放大镜下,用肉眼观察,卡尺测量评估损伤程度:1分为损伤(包括糜烂点)<1 mm;损伤介于1～2 mm为2分;损伤介于2～3 mm为3分;损伤介于3～4 mm为4分;损伤>4 mm为5分;损伤宽度>2 mm的时候计分加倍。UI评分为胃黏膜各处损伤计分后值的累加。

1.5.4 ELISA法检测TNF-α、IL-1β浓度:腹主动脉取血,3000 r/min离心20 min,收集上清液,并在-80 ℃冰箱中储存待测。严格遵照ELISA试剂盒方法说明进行操作,计算TNF-α、IL-1β的浓度。

1.5.5 免疫组织化学法检测胃黏膜组织TLR4、MyD88、NF-κB p65表达:严格按照试剂盒方法进行操作,将常规石蜡包埋和组织切片经抗原修复后,用正常羊血清液封闭20 min,将配制好的TLR4工作液(1∶50稀释)以及MyD88、NF-κB一抗工作液(1∶100稀释)滴加在组织上,4 ℃过夜,PBS洗涤后滴加生物素化第二抗体、辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP),DAB显色、复染、封片后,400倍的显微照相,并进行图像分析。

1.5.6 Western blot检测胃黏膜组织TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达:取100 mg胃黏膜固体组织,在培养皿中剪碎成3 mm×3 mm左右的小块,使用0.5～1 ml冷RIPA裂解液进行匀浆,充分裂解后,离心20 min(4 ℃、10000 r/min)取上清液,蛋白浓度采用BCA法测定。进行电泳、转膜、封闭,加入对应的TLR4、MyD88和NF-κB(1∶1000)一抗,4 ℃孵育过夜,用5%脱脂奶粉封闭液稀释二抗(1∶8000),室温摇床振荡反应1～2 h。洗膜10 min 3次后,ECL发光法显色。使用Gel-Pro Analyzer 4软件对结果进行灰度分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件,使用Graph Pad Prism 8软件制作图。数据均进行正态性和方差齐性检验,组间比较采用单因素方差分析,方差齐用LSD法分析,方差不齐用 Dunnett’sT3法;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 造模前及针灸预处理期间,四组大鼠摄水摄食及二便情况正常,毛发有光泽、灵活好动,精神良好,体重上升。造模期间,模型组大鼠摄水摄食量较前明显减少,大便夹有血丝,毛发暗淡,精神萎靡,体重下降;预灸组和针预组大鼠较模型组情况都较轻,与针预组相比,预灸组大鼠体重有所上升。见表1。

表1 各组大鼠造模前、预处理、造模后体重比较(g)

2.2 各组大鼠UI评分比较 见表2(图1)。正常组胃黏膜组织表面光滑,与正常组相比,模型组胃黏膜组织表面出现明显出血灶,UI指数上升(P<0.05),提示模型制备成功;与模型组相比,预灸组和针预组胃黏膜组织表面只有少量出血灶,UI指数下降(P<0.05),提示针灸预处理对预防胃黏膜损伤有效;与针预组相比,预灸组胃黏膜组织表面出血灶点更少,UI指数下降(P<0.05),提示艾灸效果强于针刺。

图1 胃黏膜组织在肉眼下的形态表现

表2 各组大鼠UI评分比较(分)

2.3 各组大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β浓度比较 见表3。与正常组相比,模型组大鼠TNF-α、IL-1β浓度上升(P<0.05);与模型组相比,预灸组和针预组大鼠TNF-α、IL-1β浓度均明显下降(P<0.05),与针预组相比,预灸组大鼠TNF-α、IL-1β浓度均明显下降(P<0.05)。

表3 各组大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β浓度比较(pg/ml)

2.4 各组大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达免疫组化结果比较 见表4(图2～4)。与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65表达均显著升高(P<0.05);与模型组比较,预灸组和针预组TLR4、MyD88、NF-κB p65表达均显著降低(P<0.05);与针预组比较,预灸组TLR4、MyD88、NF-κB p65表达均降低(P<0.05)。

图2 灸预处理对胃黏膜损伤大鼠胃黏膜TLR4蛋白表达(免疫组化染色,×200)

表4 各组大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达免疫组化结果比较

2.5 各组大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达Western blot检测结果比较 见表5(图5)。与正常组比较,模型组大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,预灸组和针预组大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.05);与针预组比较,预灸组大鼠TLR4、 MyD88蛋白表达降低(P<0.05),NF-κB p65蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图5 各组大鼠胃黏膜组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白免疫印迹图

表5 各组大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达Western blot检测结果比较

3 讨 论

胃黏膜组织作为胃的第一道保护屏障,确保胃黏膜的完整性可以增强胃黏膜组织的自我修复和防御能力,而一旦胃黏膜受到损伤,就会导致胃黏膜病变相关疾病的发生发展[11],因此对胃黏膜损伤的预防成为人们所关注的热点。《脾胃论》中指出脾胃衰而百病生,《内经》中指出正气存内、邪不可干,说明机体正气不足,会引起邪气入侵,导致疾病[12]。根据患者胃黏膜损伤后的临床表现,其在中医学中属于“胃脘痛”[13],病因主要为外邪侵袭、脾胃虚弱、生活不规律等[14]。根据中医理论,脾胃之病重在养护,脾胃为“后天之本、气血生化之源”,脾气衰则气血生化乏源,无法将水谷转化为人体所需的精微物质营养全身,导致人体阴阳失衡,容易受到病邪侵袭[15]。针灸通过“未病先防”理论调整机体生理功能,激发自我修复的能力,维持人体阴阳平衡,预防疾病发生发展[16]。孙思邈首次在《备急千金要方》中提出了灸法“治未病”理论,其中记载了灸法对于疾病的防治和保健都具有重要的作用,奠定了灸法“治未病”的理论基础[17]。艾叶作为灸法的常用中药,其味辛、苦,性温,其功用为温通散寒。脾胃喜温,艾灸可通过温热刺激固护脾胃之气,来达到调整人体气血阴阳的目的。对于胃黏膜损伤的治疗,有研究表明[18],艾灸胃经穴可增加胃黏膜血流量,减轻胃黏膜损伤病理状态。

应用六腑的下合穴与本经募穴配合,治疗六腑病证的配穴方法称为“合募配穴”[19]。“合治内腑”,下合穴常常治疗六腑相关病症,募穴偏于治疗腑病和阳经病症,合募配穴通过调畅气机来达到治疗腑病的目的[20]。足阳明胃经的下合穴为足三里,临床作为防病保健,扶正祛邪的要穴,中脘为胃之募穴,二者合用可调理脾胃、扶助正气。有实验证明[21],针刺、艾灸足三里和中脘穴可改善机体微循环,调节机体免疫功能,增强胃黏膜的自我修复和防御能力,达到理想的治疗效果。

本实验基于无水乙醇和阿司匹林混悬液制备胃黏膜损伤模型。无水乙醇可直接对胃黏膜造成损伤,并可降低胃黏膜自我修复因子的保护作用,是一种高刺激性损伤胃黏膜的攻击因子[22]。阿司匹林混悬液会使环氧合酶的活性降低,从而使胃黏膜黏液、血流量降低,防御力下降[23],导致胃黏膜损伤。采用两种药物进行大鼠胃黏膜损伤模型的制备,可加大对胃黏膜组织的刺激,缩短模型制备时间,增加成功率。HE染色观察大鼠胃黏膜组织病理学变化,可见大鼠胃黏膜组织出现出血灶,并且有炎性细胞浸润,提示模型制备成功。

TLR4/MyD88/NF-κB信号通路是调控炎症反应的重要途径之一,在免疫及炎症机制中发挥着重要作用[24]。TLRs是一类机体内天然的免疫受体,MyD88作为TLR4的下行信号因子[25],在炎性因子(TNF-α、IL-6)进入细胞内时,TLR4介导MyD88下行表达,进而磷酸化NF-κB因子,激活炎性因子的释放,参与炎症反应[26]。在本实验研究中,与正常组相比,模型组大鼠胃黏膜组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65表达均显著升高;与模型组比较,预灸组和针预组大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达显著降低;与针预组比较,预灸组大鼠TLR4、 MyD88蛋白表达降低,NF-κB p65蛋白表达差异无统计学意义。结果表明,针灸预处理可通过影响TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达水平,减少炎性因子的释放,抑制通路的级联反应,从而预防胃黏膜的损伤程度。

综上所述,针灸预处理可以降低TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平,减少炎性因子的释放,增强胃黏膜的自我修复和防御能力,从而对胃黏膜起到保护作用。与针预组比较,预灸组大鼠TLR4、 MyD88蛋白表达降低,NF-κB p65蛋白表达差异无统计学意义,提示针刺和艾灸两者对胃黏膜保护的效应相同,可能调控的机制存在着不同,需要进行进一步的研究探讨,为临床提供实验依据。