通窍活血汤对血管性痴呆大鼠海马组织miR-9、miR-124表达水平的影响

邹莉芳,卢昌均,魏晓玲,杨 茜,顿玲露,王少洲

(1.广西中医药大学研究生院,广西 南宁 530004;2.柳州市中医医院 柳州市壮医医院,广西 柳州 545001)

血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是一种常见的痴呆类型,由各种脑血管疾病导致脑损伤而致获得性智力损害,其临床表现以记忆能力的减退及认知功能的下降为主。通窍活血汤源自清代医家王清任编著《医林改错》,是活血化瘀类的代表方剂,也是治疗头窍部疾病的经典名方,书中述“治头面,四肢,周身血管血瘀之证”,说明该方有活血化瘀通络、开窍醒神的作用。现代药理学表明通窍活血汤可提高血脑屏障通透性、扩张脑血流量,促进血液循环、改善血流动力、减轻脑水肿,并通过增强脑细胞缺氧的耐受性、促进血管生成[1-2]来改善脑损害症状。

本实验通过建立VD模型大鼠,干预4周,通过卒中指数、神经病学症状评分进行评分,使用Morris水迷宫检测观察大鼠行为学改变,RT-qPCR法检测大鼠海马组织miR-9、miR-124含量,HE染色观察大鼠海马病理学结构情况。探讨通窍活血汤治疗VD的作用机制及影响,为通窍活血汤治疗血管性痴呆提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用SPF级SD健康大鼠,购自长沙市天勤生物技术有限公司,生产许可号:SCXK (湘) 2019-0013,体重约(200±20)g,予自由进食、进水喂养,动物房条件控制在温度(23±2)℃、湿度(60±3)%,12 h光照/12 h黑暗适应性喂养1周,环境安静、清洁。每日均探视观察,保证动物房的温度、湿度、光线,大鼠垫料保持干燥、食物及饮用水无菌且充足,本研究实验动物遵循ARRIVE指南和巴塞尔宣言有关规定[3]。

1.2 药物与试剂 通窍活血汤根据《医林改错》原方组成为:麝香(人工麝香)0.15 g(绢包、后下),桃仁、红花、生姜各9 g,赤芍、川芎各3 g,老葱3根,大枣7枚,黄酒250 ml。中药饮片由国药控股广西中药饮片有限公司提供,均委托柳州市中医医院中药制剂室加工而成。按人与动物药物剂量换算公式得出大鼠所需药物浓度为6 g/kg,并进行定容,每只大鼠每天灌胃容量为含生药2 g/ml的中药溶液[4],于4 ℃冰箱保存备用。

所需试剂如下:miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green):天根生化科技(北京)有限公司;苏木素-伊红染料、4%多聚甲醛:索莱宝生物科技有限公司。

1.3 实验仪器 全自动雪花制冰机:张家港伊威特电器有限公司;包埋机YB-6LF、石蜡切片机LEICA2235、组织摊烤片机YT-7FB:孝感市亚光医用电子技术有限公司。

1.4 实验方法、分组及给药 假手术组大鼠仅分离出双侧颈总动脉(CCA),剩余各组均采用缺血再灌注配合永久性结扎双侧CCA法[5]建立VD大鼠模型。术前禁食12 h,禁水4 h,用1.5%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后,将其仰卧固定于操作台,充分暴露颈部并用碘伏消毒,颈部以下部位保暖,沿前正中线切开颈部皮下组织,钝性分离充分暴露双侧CCA,随即使用无创动脉夹夹闭CCA 10 min,再松开无创动脉夹灌注10 min,以上步骤重复3次,经过3次缺血再灌注后使用4号手术缝线永久结扎双侧CCA,0.9%氯化钠溶液清理伤口并缝合,术后连续3 d予庆大霉素注射液喷洒伤口预防感染。建模过程中应密切观测大鼠生命体征,注意保暖,肛温维持在(37±0.5)℃,模型建立过程保持动作轻柔,避免损伤神经、血管等。造模后7 d内伤口愈合即使用Morris水迷宫实验确认模型是否成功,评估标准为:统计假手术组及模型组大鼠的逃避潜伏期,并以假手术组的作为参考值,计算出模型组的逃避潜伏期与参考值之差及占该鼠逃避潜伏期的比例>20%即为痴呆。造模失败者剔除,最终共剔除15只大鼠,每组剩余12只。

伤口愈合后,所有大鼠均适应性下水游泳2 min,排除不会游泳的大鼠,本实验12只假手术组大鼠均会游泳。造模成功大鼠的行为学表现:①VD大鼠在定位航行实验的表现为绕水迷宫池壁游泳、空间探索能力差、潜伏期长。若以上述计算VD大鼠逃避潜伏期时间来确定是否造模成功,那么本实验的造模成功率约为70%。②外形表现:造模成功的大鼠可见毛发脏乱,缺少光泽,爪甲、口唇、耳朵颜色黯淡,眼睑下垂,行动缓慢,对新鲜事物探索度下降,触之躲避反应减弱,喜蜷聚,进食及饮水减少;个别大鼠可见狂躁状,与同笼中大鼠斗殴,甚至咬食同笼大鼠。将VD大鼠随机分为三组,即模型组、中药组、安慰剂组,每组12只。

中药组大鼠服用通窍活血汤1 ml/100(g·d)灌胃,安慰剂组予中药组等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃,假手术组及模型组不予干预,共持续4周。

1.5 观察指标

1.5.1 卒中指数、神经病学症状评分:造模第1天及干预第28天次日,进行卒中指数评分。评分标准及分值如下:毛发脏乱或颤抖或发声、运动迟钝或减少、耳触觉减退、上睑下垂各1分;头翘起、眼球固定状睁开、后肢外展成“八”字、转圈、惊厥爆发样运动各3分;极度衰竭为6分。神经病学症状评分,标准及分值如下。运动:自发性探究为0分,刺激时走动为1分,正常步态为0分;步态:共济失调为1分,爬行为2分,无步态为3分;进食:能为0分,不能为1分;饮水:能为0分,不能为1分;疼痛刺激反应:疼痛刺激时可移动为0分,仅头或躯干活动为1分,肢体回缩或无反应为2分。其中卒中指数为0～3分为症状组,3～9分为可能有损害,10分以上为有损伤;神经病学症状为0分正常,1～3分轻度损伤,4～6分中度损伤,7～10分严重损伤。

1.5.2 行为学检测:干预结束后在Morris水迷宫进行检测,水迷宫直径160 cm、高50 cm,共分为4个象限,每个象限均做不同的标记为便大鼠识别记忆,水迷宫固定象限内放置一个直径12 cm,高30 cm的黑色平台,水迷宫四周为黑色帷幕且分别有不同标记便于大鼠识记,保持光线暗且稳定,便于摄像头捕捉记录,水温维持在(25±1)℃,了解各组大鼠的学习记忆能力。水迷宫实验内容分为定向航行实验和空间探索实验两个部分。

1.5.2.1 定向航行实验:实验共进行5 d,第1天水迷宫内不设置平台,以熟悉水迷宫环境为主,让大鼠自由游泳120 s。第2天起正式实验,每只鼠每天进行8次,持续至第5天,每天均在固定时段,以减少不同时段大鼠状态差别导致结果有差别。训练时,将大鼠分别从不同象限边缘的中点将大鼠面向池壁放入水迷宫中,若大鼠在120 s内找到平台,允许其在平面上休息10 s,若大鼠未在120 s内找到平台,则引导大鼠找到平台,让其在平台上休息10 s,再次进行下一象限入水实验,每个象限依次进行。使用自由录像记录系统记录大鼠逃避潜伏时间、游泳路线及速度等。

1.5.2.2 空间探索实验:定位航行实验结束次日,测量大鼠保持对平台空间位置的记忆能力。实验第6天,撤除水迷宫逃生平台,并任意选个象限中点作为落水点将大鼠放入水迷宫中,所有大鼠都应从同一落水点入水,记录并比较各组大鼠在120 s内穿越原目标区域平台的次数。

1.5.3 RT-qPCR法检测大鼠海马miR-9、miR-124含量:每组随机取部分大鼠麻醉后断颈处死,在冰浴中快速剥离海马,将海马组织放入标记好的EP管后至-80 ℃冰箱冻存留作备用。按照RT-qPCR说明书进行海马组织的RNA提取并测定浓度,对提取的RNA进行逆转录,最后使用PCR仪器进行测定,并用2-ΔΔCt法计算出各目的基因的表达含量。

1.5.4 HE染色观察海马组织形态:每组随机取部分大鼠深度麻醉,快速谨慎剖开胸腔充分暴露心脏,止血钳夹持心尖并固定,注射针头从心尖刺入,进入主动脉后剪开右心耳,快速注入0.9%氯化钠溶液,置换出血液,可见大鼠肝脏变白、流出的血液转为无色液体时即转为4%多聚甲醛持续灌注,可见大鼠四肢及尾部抽动,待大鼠全身僵硬后停止灌注。灌注完成后快速断颈取脑,将大脑置于4%多聚甲醛内过夜,次日脱水、包埋并切片,切片厚度2.5 μm,切片后进行烤片、脱蜡、染色、脱水、中性树脂封膜,显微镜下观察海马组织形态。

1.6 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行分析。本实验计量资料均呈正态分布,以均数±标准差表示,采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠卒中指数、神经病学症状评分比较 见表1。造模第1天,与安慰剂组比较,假手术组大鼠卒中指数及神经病学症状评分均降低,差异具有统计学意义(P<0.05),模型组及中药组大鼠的卒中指数及神经病学症状评分比较差异均无统计学意义(P>0.05);干预第28天,各组大鼠评分均下降,与安慰剂组相比,假手术组及中药组大鼠的卒中指数及神经病学症状评分均明显下降(P<0.05),模型组大鼠的卒中指数及神经病学症状评分比较差异均无统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠卒中指数评分和神经病学症状评分比较(分)

2.2 各组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数比较 见表2。与安慰剂组相比,假手术组及中药组逃避潜伏期耗时缩短,穿越平台次数增多,差异有统计学意义(P<0.05),模型组逃避潜伏期耗时及穿越平台次数相当,差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数比较

2.3 各组大鼠海马组织miR-9、miR-124表达水平比较 见表3。与安慰剂组比较,假手术组及中药组大鼠海马组织miR-9、miR-124表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),模型组大鼠海马组织miR-9、miR-124表达水平稍降低,差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠海马组织miR-9、miR-124表达水平比较

2.4 各组大鼠HE染色结果 假手术组大鼠海马组织神经元结构完整,无明显丢失现象,细胞排列整齐、分布密集有序,形态良好,细胞核染色均匀;模型组及安慰剂组大鼠海马组织神经元结构残缺,神经元丢失现象明显,细胞排列凌乱,数量减少,分布疏散杂乱,形态不规则,细胞外观肿胀,与周围组织间隙增大,细胞核染色不均匀,细胞核形态固缩;中药组大鼠海马组织神经元结构相对完整,神经元有少量丢失,细胞排列相对有序,分布较安慰剂组大鼠的密集,形态欠规则,细胞水肿减轻,与周围组织间隙缩小,细胞核染色程度减低,细胞核固缩形态相对减少(图1)。

··A:假手术组;B:模型组;C:中药组;D:安慰剂组

3 讨 论

VD是目前世界上公认的唯一可防治的痴呆类型,及早治疗甚至有可逆性可能。VD在中医中虽无对应病名,亦未与其他呆病相互区分,但据其临床症状,属于中医“痴呆”“健忘”“呆病”“痴呆”等范畴。中医认为痴呆病位在脑,与五脏关系密切。古代医家认为痴呆可能是由于肾虚、肝郁、痰浊、血虚或瘀血所致,治疗上往往从补肾补精、健脾益气、化痰开窍、活血化瘀、安肝养阳、安神养心等方面入手,中药多选用补虚药、活血化瘀药、开窍药等。鄢海良等[6]通过网络药理学研究显示,通窍活血汤中各药有效成分可通过血脑屏障,提高脑代谢率、增加脑血流量、改善神经功能缺损症状等,通过抑制自由基氧化反应、保护血脑屏障、调节脑血流、加强血管再生能力、促进神经元再生,遏抑或促使神经传递介质的释放等作用机制治疗VD。

通窍活血汤出自清代名医王清任所著《医林改错》,其为头窍部瘀血要方,方由麝香、桃仁、红花、赤芍、川芎、大枣、鲜姜、老葱、黄酒等组成,方中桃仁、红花为对药,两药互相配伍善于活血散瘀通经;川芎素有“血中气药”之称,专于活血行气;赤芍可清热凉血散瘀;麝香更擅开窍醒神,加之活血通络,配合姜、枣、老葱、黄酒更能通络开窍,通达气运血行之道路,使得全方共奏活血化瘀、开窍通络之效。王清任立该方以“治头面四肢、周身血管血瘀之症”,现代临床仍有延续使用该方治疗血管性痴呆之头窍部血瘀证,其取得的临床疗效获得肯定。孙晓丽等[7]发现,通窍活血汤改善VD大鼠症状是通过改善维生素B6及脂肪酸代谢、促进类固醇激素生物合成等代谢通路实现的。刘江华等[8]表明通窍活血汤改善VD症状可能是通过调节血管新生因子,即抑制血管因子ET-1、促进生成VEGF发挥作用。张立娟等[9]证明通窍活血汤可通过降低Glu的神经兴奋毒性来改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能。本研究选取miR-9、miR-124作为研究内容,探讨二者与VD的关系,阐明通窍活血汤治疗VD的可能作用机制。但是,由于中草药及复方含有的化学成分多样复杂,难以捕捉到究竟是哪种化学成分对VD的发病机制起治疗作用,还需进一步研究探索。

海马体位于内侧颞叶部,海马区是与学习和记忆有关的最关键的大脑区域之一,当大脑发生缺血性损伤时,以海马CA1区最为敏感的区域非常容易受到损伤,海马区神经元的数量及其结构的完整性和突触传递的有效性均可直接影响认知功能,海马的功能和形态紊乱是导致认知功能障碍的重要因素[10]。林聪等[11]使用活血化痰胶囊治疗VD大鼠可促进其海马区Bcl-2的表达以缓解氧化应激反应,促进大鼠的空间学习记忆能力恢复。本实验发现,假手术组大鼠的海马组织神经元细胞形态无明显破坏,大鼠学习记忆能力无明显下降,而模型组大鼠海马组织神经元形态破坏明显,其学习记忆能力均有不同程度下降,使用通窍活血汤治疗后的大鼠海马组织神经元形态相对恢复,其学习记忆能力得到改善,说明通窍活血汤可影响海马组织神经元形态,促进神经元细胞修复,进而改善VD大鼠的认知能力障碍。通窍活血汤促进海马神经细胞修复是通过何种机制实现的,目前尚未阐明,近年来不断有新的研究表明miR-9、miR-124在大脑发育特别是认知功能方面起重要作用,我们猜测通窍活血汤可能是通过调控miR-9、miR-124的表达促进海马区病理形态恢复而起到改善认知障碍的作用。但通窍活血汤究竟是通过何种途径调节miR-9、miR-124的表达水平尚鲜有研究,同时这也是本研究的不足之处,在后续的研究中可进一步探讨。

微小核糖核酸(miRNA)是一种小的非编码RNA,结合在mRNA的特定位点,转录后调节基因表达[12],在许多神经系统疾病的中发挥重要调控作用。有研究显示,VD患者大脑中的mRNA会出现异常调控的情况[13]。miR-9和miR-124均是miRNAs家族中的成员之一,二者在大脑中表达含量丰富,特别是在发育过程中尤为突出[14-16]。与健康成人相比[17-18],AD患者大脑中颞叶新皮层、海马区等与记忆功能相关的区域miR-9表达水平显著升高,结合本实验的结果,VD 模型大鼠的学习记忆能力出现障碍可能与过度表达的miR-9相关,VD大鼠海马组织中miR-9的表达含量明显升高。由于miR-9可促进血管内皮细胞VEGF表达,故对血管生成具有促进作用[19]。此外,miR-9的表达受到抑制时,慢性脑灌注不足模型大鼠的学习和记忆能力可得到一定程度的改善,并能够通过调节神经元、增强突触可塑性、减少神经元丢失等途径而发挥脑保护作用[14,20]。经通窍活血汤治疗后大鼠海马组织的miR-9、miR-124表达水平下降,综上,推测通窍活血汤治疗VD的途径可能是通过其改善局部脑灌注及代谢、调节突触可塑性、调节神经元等途径,促进miR-9及miR-124在病理状态下改善内环境,起到改善认知障碍的作用。

综上所述,通窍活血汤可有效改善VD大鼠的空间学习记忆障碍程度,VD大鼠的学习记忆功能与海马神经元结构破坏程度具有一定相关性,miR-9、miR-124的异常表达可能是VD的发病机制之一,通窍活血汤治疗VD可能是通过抑制miR-9、miR-124的过度表达发挥治疗作用。