基于TGF-β1/Smad2/3信号通路研究芪参六味方对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响

惠嫣然,董 菲,贾文浩,肖华丽,余林波,黄丽君,毛天诗,林 谦,周 鹍

(1.北京中医药大学,北京 100029;2.北京市宣武中医医院,北京 100050;3.北京中医药大学第三附属医院,北京 100029;4.浙江大学医学院附属邵逸夫医院新疆兵团阿拉尔医院,新疆 阿拉尔 843300;5.北京中医药大学东直门医院,北京 100700;6.北京中医药大学东方医院,北京 100078)

2018年我国18岁以上的居民高血压加权患病率达到27.5%,估计中国高血压病患病人数已接近3亿,且患病率总体呈增高趋势[1]。高血压病患者血压长期升高常造成心肌损伤,心肌损伤后过度代偿修复可导致心肌纤维化(Myocardial fibrosis,MF)。MF可进一步导致心脏舒张功能下降[2],是各种心血管疾病走向心力衰竭的主要途径[3]。MF的病理基础为心脏组织中心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFBs)的病理性增多及细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的过度沉积[4]。基质金属蛋白酶(MMP)与基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是调节ECM动态平衡的关键酶[5]。转化生长因子-β/Smads(TGF-β/Smads)信号通路是促进MF的重要通路[6],能够调节MMP/TIMPs的平衡,促进ECM的产生和增殖,导致MF的发展[7]。

芪参六味方是北京中医药大学林谦教授立足于气血理论而拟定的经验方,具有益气活血,补益肝肾的功效。课题组所在团队前期已进行多项临床研究[8-10],研究结果均表明芪参六味方治疗高血压舒张功能障碍疗效显著,且安全可靠。在此基础上,本研究旨在进一步探讨芪参六味方是否通过调控TGF-β1/Smad2/3通路改善MF,从而改善心脏舒张功能,为临床提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 20周龄雄性自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR),同龄雄性魏-凯二氏大鼠(Wistar-kyoto rats,WKY),SPF级,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012-0001。饲养于北京中医药大学东直门医院医学实验中心SPF级动物房,恒温恒湿,专人喂养。

1.2 药物与试剂 芪参六味方配方颗粒,其原方组成为:生黄芪、丹参、川芎、葛根各30 g,熟地黄、泽泻、益母草各15 g,三七、山茱萸、茯苓、夏枯草各10 g。按比例提取为配方颗粒,应用时使用无菌蒸馏水配制灌胃液进行灌胃。氯沙坦钾片(国药准字J20180054),使用时无菌蒸馏水溶解。

30%丙烯酰胺(北京索莱宝生物科技有限公司)、1 mol/L Tris-HCL(pH6.8)(北京索莱宝生物科技有限公司)、1.5 mol/L Tris-HCL(pH8.8)(北京索莱宝生物科技有限公司)、4×蛋白上样缓冲液(北京索莱宝生物科技有限公司)、PCR引物(北京Invitrogen公司)、预染蛋白marker(美国thermo公司)、PVDF膜(美国MILLPORE公司)、Masson染色试剂盒、天狼猩红染色试剂盒、增强型ECL试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)、一抗GAPDH(美国bioworld公司)、二抗(美国KPL公司)。

1.3 实验仪器 小动物超声心动检测仪(美国Visual Sonics公司)、凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)、涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、离心机(德国Eppendorf公司)、荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、电泳仪、垂直电泳槽、转移槽(北京六一仪器厂)、分光光度计(美国Therno scientific公司)。

1.4 分组与给药 将15只20周龄雄性SHR大鼠随机分为模型组、中药组、氯沙坦钾组,每组5只,5只同龄雄性WKY大鼠作为对照组;适应性喂养1周后,各组给予相应药物灌胃,共干预12周。具体方案如下:①中药组剂量为34.16 g/(kg·d),相当于临床常用剂量;②氯沙坦钾组剂量为8.33 g/(kg·d),相当于临床剂量50 mg/d;③对照组与模型组予等量无菌蒸馏水。

1.5 观察指标

1.5.1 超声心动检测:使用Vevo770型小动物超声心动检测仪检测大鼠心脏功能。大鼠脱毛后,使用2%异氟烷持续吸入待角膜反射消失。在左室短轴位的乳头肌水平,测量并计算左室射血分数(LVEF)与左室短轴缩短率(LVFS);心尖四腔心切面,测量舒张早期跨二尖瓣血流速度(E)与舒张早期二尖瓣环运动幅度(E’),计算E/E’值。每个参数均在同一部位重复测量3次,取平均值。

1.5.2 左室心肌病理染色及胶原含量测定:将大鼠断颈处死后迅速取左室心肌组织,4%甲醛溶液中固定48 h后,石蜡包埋切片。进行Masson染色及苦味酸-天狼猩红染色。在普通光学显微镜下观察胶原纤维含量及分布,Masson染色下胶原纤维呈蓝色,苦味酸-天狼猩红染色下胶原纤维呈粉红色;在偏光显微镜下观察Collagen Ⅰ与Collagen Ⅲ含量及分布。利用Image-pro Plus 6.0图像分析软件测量两种胶原纤维的面积,并计算Collagen Ⅰ/Collagen Ⅲ比值。

1.5.3 Western blot法测定各组大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表达:采用Western blot法检测。心肌组织研磨后加入RIPA细胞裂解液充分裂解,离心提取蛋白,制备SDS-PAGE凝胶,电泳;将蛋白转印至PVDF膜上,室温下封闭1 h,加入一抗工作液,在4 ℃条件下反应过夜;TBST洗膜后加入二抗工作液,室温孵育1 h,再次洗膜;加入ECL发光液显影。完成后使用UVP凝胶成像分析系统,采图并分析灰度值。

1.5.4 RT-PCR法检测各组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达:采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)法检测。按照Trizol试剂说明书提取心肌组织中的总RNA,用分光光度计检测纯度及含量;参照Real-Time PCR试剂盒说明书将提取的RNA反转录成cDNA,加入相应引物进行扩增,引物如下(购自北京Invitrogen公司)。GAPDH:上游5’-CTGACTTCAACAGCGACACCCA-3’,下游5’-CCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’;TGF-β1:上游5’- TTCCTGGCGATACCTCAGCAACC-3’,下游5’- TCAATTTCCCCTCCACGGCTCA-3’;Smad2:上游5’- TCATGCCAACAGAAAACTTCGAG-3’,下游5’- TTCCTTAGACTGTGGGATGC-3’;Smad3:上游5’- AGGGCTGCTCTCCAATGTCA-3’,下游5’- CGAAGACCTCCCCTCCGAT-3’;目的基因和内参分别进行RT-PCR反应。每个样本检测3个复孔。数据采用2-ΔΔCt法分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS 24.0 统计学软件进行分析。数据资料均为计量资料,以均数±标准差表示。组间差异比较用单因素方差分析;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心脏收缩与舒张功能比较 见表1。与对照组比较,模型组大鼠LVEF、LVFS均明显降低(P<0.05),E/E’明显升高(P<0.05);与模型组比较,中药组与氯沙坦钾组E/E’显著下降(P<0.01)。结果表明,芪参六味方可显著改善SHR大鼠的左室舒张功能。

表1 各组大鼠心脏收缩与舒张功能比较

2.2 Masson染色及各组大鼠心肌胶原纤维面积比较 Masson染色结果显示,对照组大鼠心肌肌束间有少量的蓝色胶原纤维,排列均匀。与对照组比较,模型组蓝色区域明显扩大,心肌肌束间隙增宽,在心肌细胞间质中可见明显的纤维化改变,且伴有较多胶原沉积。与模型组比较,中药组与氯沙坦钾组MF程度较轻,胶原含量较少,排列较均匀。见图1。

图1 大鼠心肌组织胶原纤维分布图(Masson染色,×400)

心肌胶原纤维面积百分比比较显示,与对照组(0.06±0.06)%相比,模型组胶原纤维面积百分比(4.12±3.72)%显著升高(P<0.01);与模型组比较,中药组(0.45±0.57)%、氯沙坦钾组(0.34±0.52)%胶原纤维面积显著缩小(P<0.01)。

2.3 苦味酸-天狼猩红染色及各组大鼠Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ分布比较 在普通光镜下,苦味酸-天狼猩红染色淡黄色区域代表心肌细胞,粉红色区域代表胶原纤维。对照组心肌间质中胶原纤维含量较少,排列均匀;与对照组比较,模型组胶原含量明显增多,排列紊乱;与模型组比较,中药组及氯沙坦钾组胶原含量均减少,排列较均匀,其中中药组胶原纤维含量最少,排列均匀,与对照组差异较小。

在偏光显微镜下观察经苦味酸-天狼猩红染色左心室心肌组织切片,可以清晰显示Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ,Collagen Ⅰ纤维排列紧密,呈橙黄色或亮红色,Collagen Ⅲ分布在Collagen Ⅰ周边,呈绿色。对照组心肌胶原分布均匀,含量较少;与之比较,模型组可见胶原纤维数量增多,排列紊乱,以Collagen Ⅰ增多为主;与模型组比较,中药组及氯沙坦钾组胶原纤维面积减小,以Collagen Ⅰ减少为主,排列紊乱较轻。见图2。

图2 普通光镜及偏光显微镜下大鼠心肌组织胶原纤维分布图(苦味酸-天狼猩红染色,×400)

偏光显微镜下计算大鼠左室心肌组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ面积比值百分比,结果显示,与对照组比较,模型组比值显著增大(P<0.01);与模型组比较,中药组、氯沙坦钾组比值明显减小(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠CollagenⅠ与Collagen Ⅲ面积比值比较(%)

2.4 各组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9及TIMP-1蛋白表达水平比较 见表3(图3)。Western blot结果显示,与对照组比较,模型组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组比较,中药组与氯沙坦钾组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表达量显著下降(P<0.01)。与对照组比较,模型组MMP-9蛋白表达量显著升高(P<0.01),TIMP-1蛋白表达量显著降低(P<0.01);与模型组比较,中药组MMP-9蛋白表达量明显降低(P<0.05)。结果表明,芪参六味方可以调节MMP-9/TIMP-1的平衡,降低SHR大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达,减轻MF程度。

图3 各组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9、TIMP-1蛋白表达

表3 各组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9及TIMP-1蛋白表达水平比较

2.5 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达水平比较 见表4(图4)。与对照组比较,模型组TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达量均显著升高(P<0.01);与模型组比较,中药组TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达量均显著降低(P<0.01),氯沙坦钾组Smad2、Smad3蛋白表达量明显降低(P<0.05,P<0.01)。结果表明,芪参六味方可能通过调控TGF-β1/Smad2/3通路相关蛋白的表达,改善SHR大鼠MF。

表4 各组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达水平比较

2.6 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达水平比较 见表5。与对照组比较,模型组TGF-β1、Smad2 mRNA表达水平均显著升高(P<0.01),Smad3 mRNA表达水平有升高趋势;与模型组比较,中药组TGF-β1 mRNA表达水平显著降低(P<0.01),中药组、氯沙坦钾组Smad2 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。结果表明,芪参六味方可能通过调控TGF-β/Smads通路TGF-β1、Smad2 mRNA的表达,改善SHR大鼠MF。

表5 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达水平比较

3 讨 论

高血压归属于“眩晕”范畴,临床应用较为广泛,另外“头痛”“脉胀”“肝风”等临床中也常有应用。《素问》言:“诸风掉眩,皆属于肝。”肝主疏泄,若肝气郁滞,则疏泄失职,肝郁日久化火则肝火亢盛,阴伤无以潜阳,则肝阳上亢,肝肾同源,虚损及肾,则肝肾亏虚,因此临床多从肝肾论治高血压。随着病情的进展,高血压心肌纤维化患者可能出现心悸、气喘、胸闷、胸痛等症状,因此根据患者临床特点,常将心肌纤维化归属于“胸痹心痛”“心悸”和“喘证”等范畴。也有学者将高血压心肌纤维化命名为“风眩合并心胀”[11]。周明龙等[12]基于“久病入络”理论,认为“血瘀”是高血压心肌纤维化的基本病机,治疗当以活血化瘀为主。吴美芳等[13]认为本病病性为本虚标实,阳虚为本,痰浊、瘀血为标,治疗以益气温阳、活血祛痰为法。王奇林等[14]认为本病以心、肝、肾阴虚阳亢为主,长期心阴不足导致水湿、血瘀内停,治疗当以滋阴潜阳为法,兼以祛湿化瘀。蒋嘉烨等[15]认为本病属痰湿壅盛,治疗以化痰息风、健脾祛湿为法。基于长期的临床观察和团队前期的一项横断面调查发现,高血压合并舒张功能障碍患者表现为“肝肾不足,气虚血瘀”的证候特点[16]。《医学真传》言:“人之一身,皆气血之所循行,气非血不和,血非气不运”。“气为血之帅,血为气之母”,心主血脉,心气可推动血液运行,濡养周身,肝肾不足日久心气亦虚,心气虚则血液运行无力,而致心脉瘀阻。血瘀进一步又阻碍气机,进而加重气虚,最终导致心肌纤维化。由此可见,肝肾不足、气虚血瘀是高血压心肌纤维化的核心病机,治疗当以益气活血、补益肝肾为主。

芪参六味方立足于气血理论而创立,具有“益气活血、补益肝肾”的功效。前期团队基础研究证实,黄芪、党参、丹参等益气活血药物可以改善舒张性心力衰竭大鼠的心室舒张功能[17]。采用黄芪、丹参干预受Ang Ⅱ刺激后肥大的心肌细胞,发现可显著降低心肌细胞总蛋白含量的代偿性表达,抑制心室重构[18],且能通过调节钙稳态改善肥大心肌细胞的舒缩功能[19]。课题组所在团队前期已进行了多项随机对照临床研究,其中一项随机、对照、双盲临床试验研究纳入了104例高血压舒张功能障碍患者,结果发现,芪参六味方干预8周后,治疗组中医证候积分和主要症状积分降低,症状改善明显,左室舒张功能及左室舒张末内径均较对照组有显著改善[8]。

MF是高血压出现心脏舒张功能障碍的病理基础和必经环节。MF可使心肌的僵硬度增高,进而导致心肌顺应性下降[20]。E/E’是判断心脏舒张功能的重要指标,E/E’≥8提示存在舒张功能障碍[21]。高血压MF最终可导致心力衰竭,且与心血管死亡风险直接相关[22],因此MF的防治至关重要。中医药在改善高血压症状及心脏功能、抑制或逆转MF等方面具有一定优势。丁秀婷等[23]发现银杏内酯B可抑制SHR大鼠心肌纤维化。朱力权[24]采用益气活血补肾法治疗高血压左室舒张功能障碍,发现相较于传统西药治疗,益气活血补肾法可有效改善临床症状,并有助于控制血压和改善心脏舒张功能。宋晓龙等[25]采用补虚泻实、活血化瘀法治疗冠心病心力衰竭,发现利心水方在改善冠心病心衰患者心肌重构方面功效显著,可一定程度上改善心肌纤维化。芪参六味方临床已应用多年,疗效显著,但仍缺乏相应的基础研究证据,因此本研究采用SHR大鼠模型,通过对比中药组与模型组心脏的收缩与舒张功能、心肌组织纤维化病理改变、纤维化及TGF-β1/Smad2/3信号通路相关蛋白及mRNA表达水平,证实芪参六味方可以通过TGF-β1/Smad2/3通路改善SHR大鼠MF。

ECM主要由Collagen Ⅰ与Collagen Ⅲ组成,胶原纤维可维持心肌纤维排列[26],影响心室僵硬度[27]。ECM的过度沉积是MF的主要病理特征之一,主要表现为胶原空间结构排列紊乱、胶原蛋白的大量沉积及Collagen Ⅰ与Collagen Ⅲ比例失调等[4],从而导致心肌顺应性下降,影响心脏舒张功能。本研究采用SHR大鼠MF模型,干预12周后检测大鼠的心脏舒缩功能,结果显示,模型组大鼠LVEF、LVFS均明显低于对照组,E/E’明显升高,说明模型组大鼠心脏收缩、舒张功能出现障碍;取大鼠心肌组织进行观察,相较于对照组,模型组心肌细胞间质中纤维化改变明显,胶原大量沉积,Collagen Ⅰ与Collagen Ⅲ比例失调,以Collagen Ⅰ增多为主。相较于模型组,中药组E/E’明显降低,心脏舒张功能明显改善,镜下可见胶原沉积减少,胶原纤维排列结构均匀,且主要以降低Collagen Ⅰ为主。氯沙坦钾组以上结果与中药组相似。说明芪参六味方可通过改善ECM的沉积,抑制或逆转MF,改善SHR大鼠的舒张功能,且效果不劣于氯沙坦钾。

MMP/TIMPs比值失衡在MF中起着至关重要的作用,常作为MF的生物标志物,MMP可诱导ECM中包括胶原纤维在内的各种蛋白质的降解,TIMPs是MMP的内源性特异性抑制酶[5]。MF发展过程中,TIMP-1持续上调,MMP-9对ECM的调节与TGF-β/Smads信号通路有关[28],且与MF呈正相关[29]。MMP/TIMPs之间的平衡对于心肌组织中ECM的重建至关重要,因此本研究对大鼠心肌组织中MMP-9、TIMP-1蛋白表达水平进行测定,发现模型组MMP-9蛋白表达水平显著升高,TIMP-1蛋白表达水平显著降低;相较于模型组,中药组主要降低了MMP-9蛋白表达水平,一定程度上改善了MMP/TIMPs比值失衡,从而减轻ECM的异常沉积,促进ECM重建,抑制甚至逆转MF进程。

高血压病血压升高导致的心肌组织压力负荷升高及RAAS系统的激活是造成MF的主要原因之一[30]。TGF-β是一种多功能细胞因子,参与成纤维细胞增殖、转化和迁移的调节,以及ECM的产生[31]。高血压可通过血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)上调TGF-β1的表达和释放[32],TGF-β1是调节MF的重要因子,其上调或激活是导致MF的多种机制的共同途径和中间桥梁[33],且其表达水平与疾病严重程度可能存在一定相关性[34]。TGF-β/Smads信号通路是导致MF最经典的一条通路。通路激活时,Samd2/3被大量磷酸化,诱导TGF-β1蛋白信号转导,介导后续信号通路的传递[6],影响MMP/TIMPs之间的平衡[7],进而造成ECM的异常沉积。本研究对大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表达水平进行测定,模型组大鼠TGF-β1与Smad2蛋白及mRNA表达水平、Smad3蛋白表达水平均明显升高,提示TGF-β1/Smad2/3通路调控本研究MF模型的发生发展。相较于模型组,中药组TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达水平显著降低,表明芪参六味方可以通过抑制TGF-β1/Smad2/3通路的过度激活,调节MMP-9/TIMP-1之间的平衡,减轻细胞外基质的沉积,抑制或逆转MF,改善SHR大鼠左室舒张功能。

综上所述,MF是高血压发展到心脏舒张功能障碍的病理基础,TGF-β1/Smad2/3通路是促进MF的一条经典通路。本研究针对高血压MF肝肾不足,气虚血瘀的基本病机,采用芪参六味方干预SRH大鼠MF模型,证实芪参六味方可通过抑制TGF-β1/Smad2/3通路的过度激活,调节MMP-9/TIMP-1之间的平衡,抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表达,其中以抑制Collagen Ⅰ蛋白表达为主,减轻细胞外基质的沉积,抑制或逆转SHR大鼠心肌纤维化,改善SHR大鼠左室舒张功能,且芪参六味方治疗高血压MF疗效不劣于氯沙坦钾。