杜仲叶提取物及发酵物对鸡骨发育的影响

薛玉环,崔恩慧,董志坚,柴学军,孙朋浩,朱晓岩,苏印泉,张智涵,赵善廷*

(1.西北农林科技大学 动物医学院,陕西 杨凌 712100;2.西安市高新区医院影像科,陕西 西安 710000;3.西安医学院基础医学部,陕西 西安 720021;4.西北农林科技大学 林学院,陕西 杨凌 712100)

杜仲是中国临床用中药,其叶含有丰富的生物活性成分,如绿原酸、杜仲苷、熊果酸、黄酮类物质等,除此之外杜仲富含氨基酸、维生素、矿物元素等多种营养成分[1],如矿物元素镁、钙、钾、铁、磷等,具有增强免疫功能、降血脂、镇静抗应激、抗菌消炎、强身健骨等多方面作用[2]。中国饲料工业于20世纪80年代初就对中草药进行了大量的研发和应用,近几年有关中草药饲料添加剂的产品层出不穷,其中杜仲的各种饲料添加剂以其独特的药理功能和良好的饲养效果受到养殖户的青睐,尤其是在鸡的养殖中较为热门。研究发现,在日粮中添加杜仲提取物或杜仲粉可以提高肉鸡的生长性能、平均日增重、饲料转化率等指标[3-5]。也可以提高如海兰蛋鸡等蛋鸡的产蛋率[5-8],并且通过改变蛋清蛋白质含量、蛋重、蛋黄比例等指标改善鸡蛋品质[6,8-10]。笼养蛋鸡在全球范围内都是主流的饲养方式,由于蛋鸡在性成熟后结构骨会受到抑制,又因为蛋壳形成20%～40%的钙需要由髓质骨提供,所以蛋鸡更容易患骨质疏松[11-13]。蛋鸡的产蛋量、鸡蛋质量和蛋壳厚度等产蛋指标与本身的骨骼质量密切相关[11,14],因此需要维持蛋鸡的骨骼质量来保证产蛋性能。另外,中医临床常将杜仲用于治疗骨折、骨质疏松、骨性关节炎等疾病[15-16]。现代药理学研究证实杜仲的有效化学成分具有调节骨代谢、加速成骨、促进骨形成等作用[17-18]。基于杜仲治疗骨损伤性疾病的功效事实,本试验利用组织学、形态计量学、影像学、质谱等技术研究了在鸡日粮中添加杜仲叶提取物和杜仲叶发酵物对鸡骨骨质量及骨内微量元素的影响,以初步探讨其对骨骼发育的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

2日龄健康海兰蛋鸡由河南省灵宝市帅华牧业有限公司提供,所有鸡健康状况良好,体重约40 g。

1.2 仪器及试剂

杜仲叶由河南省灵宝市帅华牧业有限公司提供,杜仲叶提取物为杜仲叶水提物,杜仲叶发酵添加物为杜仲叶水提物经乳酸杆菌发酵,制成粉剂。主要试剂有磷酸盐缓冲液(PB)、酸性脱钙液、15%EDTA溶液、HE染色液、用磷酸盐缓冲液配成的4%多聚甲醛、硝酸等。主要仪器有莱卡冰冻切片机、琼脂凝胶封片剂、24孔细胞培养板、水浴锅、阶梯式蛋鸡饲养笼、日光灯等。

1.3 饲养管理及试验设计

1.3.1 试验鸡分组及饲养管理 2日龄的健康海兰蛋鸡30只,饲养于四川广安某养鸡场,试验时间为2019年9月1日-2019年11月6日,相同条件下饲喂1周后,随机分为3组:对照组(饲喂基础日粮)、杜仲叶提取物组(每千克基础饲粮添加6 g杜仲叶提取物)、杜仲叶发酵组(每千克基础粮添加10 g杜仲叶提取发酵物)。每组10只,所有试验鸡均饲喂在阶梯式产蛋笼内,每笼1只,每只每天饲喂2次总质量为0.110 kg,分别在9:00(饲喂量的65%)和18:00(饲喂量的35%)进行投食,提供自由饮水,每天平均光照16 h,所有组相同条件下饲喂60 d。

1.3.2 杜仲叶提取方法 干燥杜仲叶揉碎浸润30 min后,用80 ℃的水加热浸泡1 h,倒出液体;再将杜仲叶加入80 ℃的水加热浸泡30 min后倒出液体,2次液体合并后过滤,烘干后即得到杜仲叶提取物。

1.3.3 杜仲叶发酵方法

1.3.3.1 制菌 用杜仲基液按照营养培养基比例配方做出营养基平板,接种复合益生菌液,38 ℃恒温培养48 h,选出形态好活力佳的益生菌群,即得到杜仲益生菌种。

1.3.3.2 发酵 1级发酵:从营养培养基平板中取2个杜仲益生菌群接种于10 mL杜仲基液中,38 ℃恒温培养24 h,即得到1级菌液;2级发酵:将1级菌液接种于250 mL的杜仲基液中,38 ℃恒温培养24 h,即得到2级发酵液;3级发酵:将2级发酵液接种于1 500 mL杜仲基液中,38 ℃恒温培养18 h,即得到3级发酵液;4级发酵:将3级发酵液1 500 mL接种于30 L杜仲基液中,38 ℃恒温培养18 h,即得到4级发酵液;5级发酵:将4级发酵液接种于150 kg干燥杜仲叶粉中,搅拌均匀,于38 ℃恒温培养罐中恒温发酵48 h,即得到杜仲益生发酵湿粉。干燥:将杜仲益生发酵湿粉置于鼓风干燥仓中,以35～38 ℃鼓风干燥6 h,即得到干燥的杜仲叶发酵物,便于长期储存。

1.4 鸡骨的CT检测

CT可以分辨组织密度的轻微差别,所采用的标准就是各种组织对X线的线性吸收系数,称之为CT值,而HU(hounsfiled unit)值就是CT测定组织或器官密度大小的一种计量单位。随机挑选6只鸡的左腿胫骨使用飞利浦16排螺旋CT(型号MX16)进行CT扫描,扫描范围是左腿胫骨全长横断面,每只重复扫描3次。扫描工作由陕西省咸阳市杨凌示范区医院完成,记录保存相关数据。

扫描参数:电压120 kV,每层260 mAs,图像层厚0.75 mm,重建间隔0.75 mm,视野200 mm,窗宽4000,窗中心600,使用原机工作站处理图像,并测量骨皮质、髓腔平均HU值(即CT值)。

1.5 鸡骨形态学的测定及显微结构的观察

每组随机抽取3只鸡,剔除左腿胫骨的肉,取胫骨0.5 cm,做好标记,将清洗好的鸡骨放入用PB溶液配成的4%多聚甲醛中常温固定24 h,PB溶液浸洗10 min,清洗3次,酸性脱钙液脱钙2 h,15%EDTA液脱钙24 h,自来水冲洗24 h,20%蔗糖溶液8 h,30%蔗糖溶液24 h,OCT包埋,进行冰冻切片,切片厚度为10 μm,每只鸡随机挑选3张切片,PB溶液浸洗切片10 min,清洗3次,用勾线笔将切片裱至载玻片上,烘箱50 ℃ 约30 min,HE染色,流水冲洗1 min,琼脂凝胶封片,显微镜下观察骨组织形态结构的变化,拍照记录。

用Image-J图像分析软件对骨组织相关参数进行测定和统计。主要参数包括:骨小梁面积占比(trabecular bone area,%Tb.Ar)即测量区域内所有骨小梁的面积占测量区域的百分比;骨小梁间距(trabecular separation,Tb.Sp)指骨小梁之间的平均距离,用来描述骨小梁结构形态,分离度越大,骨小梁之间的距离越大,骨的结构越不好。

1.6 鸡骨微量元素的检测

每组随机抽取3只鸡,剔除左腿胫骨的肌肉,取0.1 g骨组织加入1 mL优级纯浓HNO3、1滴H2O2,60 ℃进行消解,待消解完全后定容至50 mL、过滤,采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,ICAP Qc)测定溶液中的Mg、Ca、Fe、Cu、Zn等元素。

工作参数:功率1 548 W,冷却气流量14 dm3/min,辅助气流量0.8 dm3/min,雾化气流量1.08 dm3/min,雾化室温度2.7 ℃,计数检测器电压1 212 V,模拟检测器电压1 869 V。

1.7 数据处理

试验数据用SPSS 21.0统计软件进行分析,各组参数差异性采用One-way ANOVA分析,组间两两比较选用Duncan's检验,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 生长期鸡骨CT值

如图1所示,将扫描CT的记录数据分析后发现杜仲叶提取物添加组的骨CT值与对照组相比极显著升高(P<0.05);杜仲叶发酵物添加组与对照组相比显著升高(P<0.05)。说明日粮中添加杜仲叶提取物和杜仲叶提取发酵物均可以显著提高骨密度,且杜仲叶提取物比杜仲叶提取发酵物在骨密度提升方面的效果更为显著。

图1 生长期鸡骨CT检查结果

2.2 鸡骨组织显微结构

鸡骨组织显微结构见图2。对照组鸡胫骨的形态结构完整性较差,疏松多孔,骨小梁稀疏,间隙增宽,髓腔相对扩大,脂肪空泡增多,部分出现断裂的现象,游离端较多,有较多大小不等的吸收腔。与对照组相比,杜仲叶提取物添加组和杜仲叶发酵物添加组的骨结构致密,吸收腔较小;骨髓腔内的骨小梁间距变小,且大都相互连接,脂肪空泡大量减少。添加杜仲叶发酵物添加组胫骨的结构更加良好,骨小梁间隙小,骨髓腔小,排列紧密,连接成网。

图2 鸡骨组织显微结构(400×)

2.3 鸡骨组织形态

对3组鸡骨组织进行切片染色,发现与对照组相比,杜仲叶提取物添加组、杜仲叶发酵物添加组的骨小梁面积占比均显著升高(P<0.001),杜仲叶发酵物添加组的骨小梁面积占比与杜仲叶提取物组相比显著升高(P<0.05);杜仲叶提取物添加组、杜仲叶发酵物添加组的骨小梁分间距与对照组相比显著降低(P<0.001)(图3)。说明杜仲叶提取物添加、杜仲叶发酵物添加对雏鸡鸡骨的显微结构有很好的改善作用。

图3 鸡骨组织形态结构

2.4 鸡骨微量元素含量

鸡骨微量元素含量测定结果见表1。与对照组相比2个试验组胫骨中的Mg、Ca、Zn水平显著增高(P<0.05);杜仲叶发酵物添加组胫骨中的Cu与对照组相比显著升高(P<0.05);2个试验组Fe的含量与对照组相比有下降趋势(P>0.05)。表明添加杜仲叶提取物和杜仲叶发酵物对雏鸡鸡骨微量元素的含量有很好的改善作用。

表1 鸡骨微量元素含量

3 讨 论

杜仲是中国特有树种,其药用历史悠久,在古医书中便有记载:“足胫之酸非杜仲不能去,腰膝之(疼)非杜仲不能(除)”[19-20],其减少骨吸收的作用较为明显[21],采用含有杜仲的中药合剂治疗骨质疏松疗效显著[22],具有很高的药用和经济价值。而且杜仲是杜仲科杜仲属仅存的孑遗植物,对于研究被子植物系统演化以及中国植物区系的起源等诸多方面都具有极为重要的科学价值。近年来,一些学者从分子水平来解释杜仲对脂肪干细胞的作用、促进成骨细胞的生成和对破骨细胞分化的影响[18,23-24]。

目前,由于大规模集约化养殖,动物活动空间非常狭小,严重影响了饲养动物骨骼的发育。关于饲料添加杜仲叶提取物和杜仲叶发酵物提高家禽骨质的研究鲜有报道,因此,此研究为预防禽类骨质疾病提供了可靠依据。

本试验采用2日龄的雏鸡,这一时期的鸡生长发育比较迅速,是骨骼生长发育的主要阶段。骨密度与CT值显著相关[25-26],本试验中的对照组CT检测鸡胫骨骨干骨密度较低,变得疏松多孔,骨小梁密度较低,成骨细胞数量少而破骨细胞数量多,吸收腔内有大量破骨细胞,骨吸收大于骨形成。这一现象说明在禽类日粮中钙缺乏时,血液钙含量降低,促进甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)的释放,刺激骨吸收加剧,机体补充血钙[27-28]。为维持骨量的恒定,其结构受到破坏,骨的皮质厚度较薄密度较低,进而引起骨质疏松的发生。同样饲养环境下,杜仲叶提取物组和杜仲叶发酵物组饲喂60 d后,这种情况有明显改善,与对照组相比这2组的骨结构致密,骨密度明显增高,吸收腔较小,成骨细胞数量多,破骨细胞数量较少。

显微镜下观察杜仲叶添加组和杜仲叶发酵添加组的显微结构发现,髓腔内的骨小梁较粗,面积大,间距小,且大都相互连接,说明在饲料中添加杜仲叶提取物和杜仲叶发酵物可以有效地预防青年蛋鸡骨强度的下降。

骨组织形态计量学和CT的试验结果发现杜仲叶提取物添加组和杜仲叶发酵组的骨小梁以及骨密度各项指标均优于对照组,说明杜仲叶提取物和杜仲叶发酵物可以在蛋鸡生长发育阶段有效地促进骨骼发育。综上所述,在鸡日粮中添加杜仲叶提取物和杜仲叶发酵物均可以有效地改善青年笼养鸡的骨代谢,使骨重建活动增加,一定程度上改善骨质疏松的症状。为了验证上述结果,本研究对胫骨进行了微量元素的检测。Mg、Ca、Zn、Cu是体内重要的微量元素,试验发现这些微量元素含量升高,表明微量元素对笼养雏鸡鸡骨的生长发育有特殊意义,微量元素不仅是各种络合性药物的作用核心,更是骨代谢各种酶的活性中心。其中Ca直接参与骨的组成,与骨骼强度直接相关,并且骨Ca在蛋鸡中参与蛋壳的形成。Mg会影响骨的生长、修复以及骨中Ca、P的代谢。Zn、Cu、Fe则间接参与骨代谢的过程。本研究发现,与对照组相比,2个试验组胫骨中的Mg、Ca、Zn等与骨结构和功能密切有关的金属离子水平显著增高,充分证明杜仲叶提取物和杜仲发酵物的添加确实可以提高骨质内的微量元素,这与本试验中CT扫描和染色的结果相符,骨密度和骨骼结构都得到了改善。这一结果可能是因为杜仲叶本身含有丰富的矿物元素,在饲料中添加可以有效提高鸡骨中的矿物元素,或是杜仲中含有可以促进骨骼吸收矿物元素的有效成分,而这些矿物元素的升高则促进了骨骼的发育和代谢。以前的研究表明成骨细胞外的铁离子浓度与成骨细胞内钙离子浓度成反比,本试验发现2个试验组与对照组相比,微量元素Fe均有下降的趋势,可能由于2个试验组细胞内钙离子浓度升高导致细胞外铁离子浓度减少所致,说明可能是钙离子的摄入不足导致铁离子的异常,而过量的铁沉积会影响正常的骨代谢[29-30],是钙离子不足条件下的一种补偿效应,添加了杜仲叶提取物和杜仲发酵物可以缓解这一现象。

本试验在鸡日粮中添加杜仲叶提取物和杜仲叶发酵物均可以改善鸡的骨发育和骨代谢,提高鸡骨内微量元素含量,使骨重建活动增加,一定程度上改善鸡的健康状况。目前蛋鸡主要采取笼养的饲养方式,即便是会定期给予一定量的运动,整体而言仍然运动不足。又由于在性成熟后,在雌激素刺激的条件下,鸡的结构骨生长受到抑制,蛋壳形成需要骨Ca的参与,导致钙负平衡,易出现笼养蛋鸡疲劳综合征,并且表现为产蛋性能大幅降低,蛋品质降低[31]。而对于肉鸡来说,也可能会因为骨骼快速生长而出现腿部骨骼问题[32]。在早期通过饮食或其他方式给予较为大量的Ca没有观察到显著的副作用,并且可以减少后期结构骨的损失[33]。

本试验的结果表明,使用杜仲提取物以及杜仲发酵物可以使骨密度更加致密,减少吸收腔,改善骨骼结构,增强骨骼硬度。这可能是杜仲通过改善骨骼对矿物元素的吸收代谢而改善的,或是通过激活骨生长的相关信号通路而实现的[34]。此外,大量的研究证实,与西药相比,杜仲皮提取物可以有效地抗骨质疏松,还降低了西药的毒副作用[35],因此我们猜测使用杜仲来预防人体骨质疏松也有较好的作用。Hussain等[36]研究表明,杜仲叶和杜仲皮所含活性成分比较相似,都含有丰富黄酮类、木质素类,本试验结果表明杜仲叶提取物和杜仲叶提取物发酵物与杜仲皮提取物中在预防和治疗骨质疏松方面具有相似的作用,因为杜仲叶比杜仲皮的采集更为便捷,对树的损伤更小,成本更低,所以应用前景更为广阔。将杜仲叶提取物和杜仲叶提取发酵物用于人类老年性骨质疏松和绝经后骨质疏松防治具有重要意义。

4 结 论

在鸡日粮中添加杜仲叶提取物和杜仲叶发酵物均可以改善鸡的骨发育和骨代谢,提高鸡骨内Mg、Ca、Fe、Cu、Zn等微量元素含量,对预防和治疗骨质疏松具有积极作用。