乙醇梭菌蛋白的特性、生产工艺及应用现状

■ 单春乔 马超鑫 刘 恩 郭雪萍 刘 星 李 笑 刘 艳* 江国托

（1.江苏三仪动物营养科技有限公司，江苏邳州 221300；2.大连三仪动物药品有限公司，辽宁大连 116000；3.江苏三仪生物工程有限公司，江苏邳州 221300）

蛋白质是三大营养物质之一，在机体生长发育和代谢过程中扮演着重要角色，具有催化、调节、营养、防御等功能，是生命活动的物质基础，生命活动离不开蛋白质[1]。近年来，我国畜牧业迅猛发展，朝着规模化、集约化、现代化方向迈进，蛋白质原料的需求不断增加。蛋白质原料短缺、价格上涨，严重限制了我国养殖行业的发展。豆粕是我国畜禽饲料的主要蛋白源，但是目前大豆主要依赖进口，且价格不稳定，受国际市场影响较大，已经成为我国畜牧业的“卡脖子”问题，因此新型蛋白源的开发应用成为研究热点。乙醇梭菌蛋白(Clostridium autoethanogenumprotein, CAP)作为一种新型蛋白源，其营养丰富，蛋白质含量高达80%，并且不含有植物蛋白中的抗营养因子[2-3]。研究表明，CAP 能够提高水产动物的特定生长率和增重率[4-5]，改善肠道健康，提高肠绒毛高度和微生物群落丰度[6]，因此在饲料行业逐渐得到重视，并进行了广泛研究。体内消化试验表明，CAP 对凡纳滨对虾的终体重、增重率、存活率和特定生长率无不良影响，并且粗蛋白的消化率高达97.74%，粗脂肪的消化率高达93.58%，是一种优质蛋白质原料[7]。对大口黑鲈的研究表明，CAP 中粗蛋白和总氨基酸的消化率都接近90%，粗脂肪的消化率更是高达97.48%[8]。此外，张健等[9]对大黄鱼的研究也表明，CAP 中粗蛋白的消化率接近90%，粗脂肪的消化率高达93.77%，总氨基酸的消化率高达93.24%，是一种理想的蛋白源，可作为鱼粉的有效替代品。

目前我国已经实现从一氧化碳到蛋白质的生物转化，可以工业化生产CAP，具有万吨级生产能力[10]。CAP 的生产、应用不仅可以减少环境污染[11]，还可以替代豆粕、鱼粉等蛋白质原料，减少粮食使用，缓解人畜争粮、争地等问题，保障粮食安全，推动养殖业的健康、可持续发展。因此，本文从CAP的特性、生产工艺和应用等方面进行综述，以期为CAP的工业化生产以及畜禽、水产养殖应用提供相关参考。

1 乙醇梭菌蛋白的特性

CAP 来源于乙醇梭菌。乙醇梭菌是一种革兰氏阳性、杆状厌氧菌，生长的最适温度是37 ℃，最佳pH为5.8～6.0[12]。目前，农业农村部已颁布相关文件，批准CAP 为新型水产饲料原料。CAP 是由乙醇梭菌在特定培养基中发酵培养获得的菌体蛋白类饲料原料，呈褐色或淡黄色粉末状，无异味，粗蛋白含量不低于80%，粗灰分小于7%，水分不高于12%。CAP 不含有抗营养因子，微量元素含量丰富[2]，胃蛋白酶消化率高达到90.4%[13]，粗蛋白含量高于豆粕和鱼粉。豆粕[14]、鱼粉[7]、CAP[7]3种蛋白质原料的营养成分差异见表1。CAP 中蛋氨酸、赖氨酸等限制性氨基酸以及支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）均高于豆粕和鱼粉，总量达25%以上。蛋氨酸是家禽的第一限制性氨基酸，支链氨基酸是mTOR 信号通路的重要激活剂，因此CAP的消化利用率较高，是一种优质的蛋白质原料。

表1 豆粕、鱼粉和CAP 3种蛋白质原料的营养水平和氨基酸组成（%）

2 乙醇梭菌蛋白发酵与提取工艺

2.1 乙醇梭菌蛋白发酵工艺

CAP 是由乙醇梭菌作为发酵菌种，利用钢铁工业煤气中的CO 和CO2作为碳源，以氨水作为氮源，由磷酸、氢氧化钾、硫酸镁、硫酸亚铁及少量维生素（维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B3、维生素B12、烟酸、叶酸及生物素）共同组成培养基，在对气体预处理后，进行发酵、蒸馏脱水、菌体分离、喷雾干燥和污水处理等几个流程[15]，最终得到乙醇等清洁能源和高蛋白质生物饲料原料，是一种来源于灭活细菌的新型单细胞蛋白[16]。

由于乙醇梭菌蛋白是产乙醇过程的副产物，Liu等[17]研究发现，乙醇在菌株指数阶段形成，与生物质生产密切相关，借助乙醇生产工艺可以探究菌体生长情况，进而为菌体蛋白积累提供依据。乙醇梭菌生长、吸光度（OD）增大、菌体浓度增大可积累乙醇梭菌蛋白。在发酵过程中，培养基成分的变化会影响微生物的生长，通过优化培养基成分和发酵条件可提高菌体积累量。

2.1.1 培养基对菌体蛋白浓度的影响

Cotter 等[18]研究表明，乙醇梭菌在蛋白胨、氯化铵和酵母粉的培养基中培养，36 h 内菌体密度降低83%；在蛋白胨和酵母粉培养基中培养，36 h 内菌体密度降低60%，在胰蛋白胨和氯化铵培养基中培养，48 h 内菌体密度增加2.1 倍；在酵母粉和氯化铵培养基中培养，48 h 内菌体密度增加1.4 倍。Xu 等[19]通过气体采样袋发酵，发酵培养基以100% CO 为底物，不添加蛋白胨和糖（木糖或果糖），结果表明细胞密度随着酵母提取物浓度的增加而增加，酵母提取物对细胞生长有着积极影响，酵母提取物1.0 g/L 时获得的最大乙醇浓度为3.45 g/L，同时获得最大菌体浓度约0.75 g/L。

原料气成分对自养代谢有重大影响，是气体发酵开发的关键因素。培养乙醇梭菌的气态碳有CO 和合成气，合成气成分由CO、CO2、H2和N2组成，补充H2可以显著提高气体发酵的效率，H2供应量的增加可显著增加乙醇的碳通量，进而导致乙醇浓度升高，相比CO为唯一碳源的发酵，高H2含量的合成气发酵几乎没有2,3-丁二醇产生，研究发现高H2还增加了菌株生物量，可见气体成分的变化对菌株代谢及方向有着显著影响[20-21]。以CO 为碳源，通过控制气体成分可提高菌体浓度，Xu 等[19]研究发现，当以100% CO 作为底物时菌体浓度最大，为0.360 g/L，以100% CO2作为底物时菌体浓度最小，为0.041 g/L，表明乙醇梭菌几乎不能利用CO2。Kracke 等[22]在以CO2为气态碳源、果糖为有机碳源发酵时，最大吸光度（OD）达1.51。研究证明，以CO2为气态碳源的发酵，生物质积累不如带有CO的培养方式[23]。

除CO、CO2、H2和N2等主要成分外，合成气中还可能含有各种类型的微量成分（如CH4、O2、HCN、NH3、NOX、H2S、COS 和CS2）。由于气化所用材料的组成和所应用的气化条件差异性，最终具体组成可能会有所不同。合成气发酵工艺的可行性与合成气杂质（如NH3、H2S 和NOX）的存在有关，超过一定阈值会造成合成气发酵困难。Oliveira 等[24]研究表明，培养基中添加任何铵、硝酸盐、硫化氢都会抑制乙醇梭菌的细胞生长，培养基内3 g/L NH4Cl 使细胞干重降低85%，0.5 g/L NaNO3使细胞干重降低约80%，0.1 g/L H2S 致使延滞期达2 h，0.3 g/L H2S 完全抑制乙醇梭菌生长，可见合成气中杂质需控制在一定范围内。

2.1.2 发酵条件对菌体蛋白浓度的影响

发酵罐控制研究表明，pH 影响菌体生长，因此pH 控制很重要，会影响菌株的生长和代谢物的产生。Xu 等[25]研究表明，pH 和氧化还原电位随细胞生长和乙酸产生迅速下降，然后随着乙醇浓度的增加而增加，菌体在快速生长阶段与乙酸含量呈正相关。Abubackar 等[26]以CO 为唯一碳源的研究发现，乙醇梭菌在pH 6.00 时立即开始生长，没有任何滞后期，而在pH 4.75 的试验中观察到24 h 的滞后期。在pH 6.00 时达到287.77 mg/L 的最大生物量浓度，比在pH 4.75 时获得的最大值高109%，并且在指数阶段发现，pH 6.00 时生物量的增加速度比pH 4.75 时快70%。这是因为pH 偏离生物体的最佳生长pH 范围（即pH 5.80～6.00），因此当pH 急剧下降时，乙醇梭菌的生长会受到限制。

实验室研究中，菌体生物量多为0.75 g/L，通过发酵过程调控生物量可达到4.00 g/L[27]，规模化生产中，某企业液态发酵罐培养乙醇梭菌浓度为20～25 g/L[28]，这可能是因为实验室和生产发酵条件不同、气液传质较低引起的。对气液传质的强烈依赖导致血清瓶中生成的数据经常偏离搅拌发酵罐中的数据。为了克服气液传质的限制，已经研究了不同的策略来增加气态碳源向液相的传质。例如，用微气泡喷射增加表面积，增加传输速率，或增加压力，增大气态碳与发酵液的溶解度，进而增大传输速率[29-30]。

2.2 乙醇梭菌蛋白提取工艺

目前，除了CAP 发酵工艺的研究，对于CAP 的提取工艺也开展了相关研究。柳入铭等[31]通过研究CAP 的分级提取工艺发现，CAP 分为水溶性、盐溶性、醇溶性以及碱溶性4 种，其中碱溶性蛋白占比最大，针对碱溶性蛋白进一步优化工艺参数发现，当提取工艺最佳时蛋白质得率为75.75%。CAP 提取工艺流程如图1[31]所示。

图1 乙醇梭菌蛋白提取工艺流程

3 乙醇梭菌蛋白的制粒特性

颗粒饲料的质量与原料种类密切相关，原料的细度、纤维和蛋白质含量等都会对饲料质量产生一定影响[32]，因此在选择原料时，不仅要关注原料的营养价值，也要关注原料的理化特性。吴雨珊等[33]通过对豆粕、菜粕、棉粕、CAP、玉米干酒糟及其可溶物（DDGS）等五种蛋白质原料的理化性质、制粒特性等研究发现，CAP 的蛋白质含量和溶解度高，纤维含量低，吸水性强，在加工参数不变的情况下，CAP 和棉粕组的制粒能耗高，豆粕组制粒能耗最低。CAP 组的硬度和糊化度最高，DDGS 组的硬度和糊化度最低。饲料颗粒质量和理化性质高度相关，蛋白质含量、溶解度和吸水性的升高会提高颗粒质量；粗纤维含量、吸水性以及蛋白质溶解度的升高会导致制粒能耗增加。经过综合比较分析发现，CAP 组饲料颗粒质量最佳，制粒特性高于其他4种蛋白质原料[13]。CAP替代豆粕的研究发现，CAP 的调质温度和替代比例不影响饲料颗粒成型率，但随着调制温度和替代比例的升高，蛋白质溶解度降低，饲料颗粒耐久性增加，硬度也逐渐增大，当替代比例超过40%时，硬度显著增加[13]。CAP 替代豆粕有利于提高饲料颗粒的硬度和耐久性。Cai 等[34]对凡纳滨对虾的研究发现，CAP 替代鱼粉可显著提高饲料颗粒硬度和容重，但对淀粉糊化度和颗粒耐久性影响不显著，此外CAP替代后饲料颗粒的溶解损失和粉末含量均显著降低。上述研究表明，CAP 作为新型饲料原料应用于水产或畜禽饲料中可以提高颗粒饲料硬度，改善饲料质量。通过对CAP制粒特性进行研究可以为其加工应用提供重要参考依据。

4 乙醇梭菌蛋白应用现状

4.1 乙醇梭菌蛋白在畜禽中的应用

CAP 是一种重要的蛋白源，在畜禽、水产中有广阔应用前景。近年来的研究发现，一定比例的CAP可以提高动物生产性能，减少豆粕、鱼粉等蛋白质原料的使用，但CAP添加量过高时可能会导致动物生产性能下降[35-36]、肠道和肝脏损伤、死亡率增加[2]。目前CAP 应用于畜禽的研究屈指可数，仅发现两项关于肉鸡的研究，无家畜相关的应用研究。吴雨珊[13]通过对白羽肉鸡饲喂不同比例的CAP发现，日粮中添加1%～5%的CAP能够降低料重比，提高饲料转化率、蛋白质吸收率，提高生产性能，并且在4%时饲料转化率最高，全净膛率、胸肌率最大，腹脂率最低。对机体抗氧化能力和肠道菌群的研究发现，CAP 可以提高肉鸡血浆中抗氧化指标的含量，改善机体抗氧化能力，提高肠道菌群的多样性和丰富度，提高机体的免疫力[13，37]。林厦菁等[38]对黄羽肉鸡研究表明，CAP 可提高机体抗氧化能力和免疫能力，改善肠道黏膜屏障，促进黄羽肉鸡的生长，适宜添加量为1.6%～4.0%。

4.2 乙醇梭菌蛋白在水产中的应用

CAP 在水产中的应用研究较多，研究结果不尽相同，但已经证明合适比例的CAP对水产动物具有一些功能性的作用，改善养殖动物健康和生产性能。例如，在建鲤幼鱼中的研究发现，饲喂CAP的鱼终体重、增重率、特定生长率、蛋白质效率显著提高，料重比显著降低；CAP 通过调节雷帕霉素靶蛋白（TOR）和核因子E2 相关因子2（Nrf2）信号通路改善生产性能，并且添加量高达20%对机体无不利影响，不会造成肝脏和肠道损伤[5]。对大口黑鲈的研究发现，CAP 可通过提高肠道抗氧化酶的活性，抑制炎症反应，加强肠道屏障和提高有益细菌的数量，有利于大口黑鲈的肠道健康[39]。在黑鲷中的研究也发现，黑鲷的特定生长率和增重率随CAP用量的增加呈先升高后降低的趋势，当替代率达到58.02%时，饲料效率和蛋白质效率显著提高，氮磷排放量显著降低，并且对鱼体组成、消化酶活性和抗氧化指标等无显著不良影响，是一种安全且优质的蛋白质原料[40-41]。此外，通过CAP 饲喂吉富罗非鱼发现，CAP 可明显改善鱼体生长，降低料重比，提高特定生长率和蛋白质利用效率，增加抗氧化状态和免疫反应[42-44]。进一步分析发现，CAP可以上调IGF-1的mRNA表达，5%和10%添加量的CAP可提高mTOR信号通路中真核启动因子4E 结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体蛋白S6 激酶1（S6K1）的蛋白和磷酸化蛋白水平，以及单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）的磷酸化水平，CAP 可能通过AMPK 信号通路调节糖脂代谢，维持能量平衡[42]。其他研究也表明，适宜比例的CAP 不会对动物生产性能造成不利影响[35,45-48]，可做为鱼粉、豆粕的有效替代品。

尽管众多研究都表明适宜比例的CAP 对生长发育和机体健康有促进作用，但是目前对于CAP的合适替代比例，研究结果不尽一致。在草鱼中，5%的CAP可以改善脂代谢，提高抗氧化能力，促进生长，但10%的CAP 会造成草鱼肝损伤，影响生产性能，死亡率增加[2]。薛荣荣[49]研究发现，CAP 可完全替代豆粕，不会对草鱼的生产性能和饲料利用率产生不利影响。CAP 替代30%的豆粕可以激活mTOR 信号通路，调节肌肉生长发育相关基因的表达，促进草鱼蛋白质的合成；CAP替代100%的豆粕可显著改善肉品质，增加肌肉氨基酸的含量[50]。Wu 等[51]对鲍鱼的研究也得出类似的结果，CAP 可以完全取代鱼粉，对生长性能无显著影响，并且当替代比例不高于50%时可显著激活mTOR 通路。对大口黑鲈的研究表明，CAP 替代鱼粉的比例低于42.86%时，对大口黑鲈的生长、饲料利用率和肠道组织学无显著影响，更高比例的CAP则会对肠道发育和抗氧化能力产生不利影响[52]。Lu 等[53]的研究结果与此类似，CAP替代鱼粉的比例低于50%不会对生长发育产生影响，过量替代则会抑制mTOR 信号通路，影响机体的健康生长。然而，Yang 等[54]对大口黑鲈的研究发现，CAP 替代鱼粉的最佳比例为67.1%～68.0%。另一项研究表明，CAP 替代鱼粉的比例低于63%时不会对存活率、增重率、特定生长率和肝脏组织学产生不利影响，并且饲喂含CAP饲料的鱼料重比更低，蛋白质效率更高，当CAP 替代水平为49.80%时，幼年大口黑鲈的增重率最高[55]。由此可以看出，CAP 的最佳替代比例仍存在较大争议，这可能是因为饲养试验受多种因素共同影响，包括试验设计（动物品种、年龄等）、饲养管理和饲料配方等。即使饲料配方的营养水平一致，但由于所用原料不同，营养物质消化率存在差异，也可能会导致试验结果的差异。因此，在生产中应用CAP，必须要考虑动物的品种、年龄和饲料配方的差异，不能盲目照搬。

5 CAP的安全性评价

单细胞蛋白源的添加比例较高时，可能会引起试验机体的健康问题甚至死亡[56]。CAP 属于单细胞菌体蛋白，尽管研究已经证明乙醇梭菌无有毒有害基因[35，57]，农业农村部也颁布了相关文件，批准其作为新型水产饲料原料。但是CAP 替代比例过高可能会影响某些动物的生产性能，甚至导致死亡率增加。研究发现高含量的CAP会影响凡纳滨对虾的生长，降低mTOR信号通路相关基因的表达量[36]。通过多组学分析表明，高含量的CAP 可能通过调节胰腺分泌、蛋白质消化吸收等途径，对蛋白质合成、营养物质利用、氨基酸和脂肪酸的代谢产生负面影响，从而影响凡纳滨对虾生产性能和肉品质[35，46，58]。CAP替代豆粕饲喂肉鸡的研究表明，CAP 在肉鸡日粮中添加量高于5%时会引起死亡率的升高，但是并未对死亡的原因做进一步的研究和解释说明。在草鱼中也有研究证实，CAP替代比例达到10%就会导致草鱼肝脏损伤，死亡率增加[2]。CAP的添加量根据养殖动物和生产阶段的不同具有一定差异，这可能与动物的种属特征和生长发育特点有关。适量的CAP对机体有一定的促生长作用，可能是由于其高蛋白含量以及消化率[2，59]，而过高比例的CAP之所以对某些动物生长发育产生不利影响，可能是因为氨基酸或其他营养物质之间的颉颃作用导致营养失衡，肠道、肝脏损伤，此外菌体中高含量的核酸也可能超过动物的耐受程度引起代谢失衡[60]。

6 展望

我国是畜产品消费大国，畜牧业的发展离不开蛋白质原料，蛋白质资源短缺，价格起伏不定，更加凸显出新型蛋白源研究的重要性和紧迫性。乙醇梭菌可以利用无机物合成有机物，减少工业废弃物的排放，产生菌体蛋白。CAP 蛋白质含量高且氨基酸较平衡，能够改善动物健康，促进动物生长，并且可以规模化、工业化生产，在畜禽饲料、替代豆粕方面具有广阔前景，对推动经济的可持续发展具有重要作用。

CAP 的应用是当前的研究热点，但是目前多集中于水产领域，在畜禽中的研究较少，尤其家畜中的研究十分匮乏，应用效果、最适剂量、调控机制等尚不清楚，在畜禽饲料应用中的有效性和安全性尚需要进一步评估。因此，乙醇梭菌蛋白应用于畜禽的安全性以及对畜禽生长发育的影响和调控机制是今后主要的研究方向，应利用组学、分子生物学等技术从分子层面揭示其调控动物生长的机制，多层次、全方位阐明其作用机理。同时，应进一步优化生产工艺和发酵条件，提高CAP产量，为CAP的广泛应用打下坚实基础，改善畜禽、水产养殖业蛋白质资源短缺局面，缓解人畜争粮等问题。