植物乳杆菌与纤维素酶组合对玉米秸秆微贮品质的影响

■ 王加黛 王利军 王 平 刘超齐 金三俊 党晓伟 常 娟 尹清强*

（1.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450046；2.河南德邻生物制品有限公司，河南新乡 453500）

玉米秸秆是我国常见的农副产品，具有纤维素含量高、适口性差、瘤胃降解率低等特点，导致其利用率低，仅为30%，直接限制了玉米秸秆资源在反刍动物粗饲料中的应用。玉米秸秆微贮主要以干秸秆为原料，通过调节水分、添加发酵菌剂密封储存，利用微生物厌氧发酵，降低其pH，达到改善饲料品质、增加营养价值、提高家畜生产性能和经济效益的目的，是一种秸秆资源化利用的有效途径[1-3]。

乳酸菌是微贮饲料中最常见的添加剂种类，进行微贮时直接加入乳酸菌制剂，能够增加发酵时的初始乳酸菌数目，加快乳酸菌发酵产酸，促使微贮pH 快速下降，从而抑制霉菌等有害微生物的生长繁殖，提高秸秆的营养价值，改善微贮发酵品质[4-5]。纤维素酶能够降解玉米秸秆细胞壁中的纤维素，降低秸秆中的纤维含量[6]，同时将秸秆中富含的多糖物质水解为单糖，为微生物的生长繁殖提供资源，促进秸秆的发酵过程[7]。常见的微贮辅料（如玉米粉、豆粕等）的添加也能在一定程度上改善发酵品质。因此，本试验通过添加发酵底物并联合使用植物乳杆菌和纤维素酶进行玉米秸秆微贮，研究其对玉米秸秆微贮品质的影响，为玉米秸秆微贮工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆取自河南省新乡市，挑选干净的玉米秸秆去根，自然风干，室温保存。植物乳杆菌来自河南农业大学饲料生物技术实验室，纤维素滤纸酶活为221.74 FPU/g。玉米粉、棉粕由河南德邻生物制品有限公司惠赠。

1.2 微贮玉米秸秆发酵底物的正交试验设计

试验采用三因素三水平正交设计，选取玉米粉（A）、棉粕（B）、水分含量（C）为考察因素，进行L9(33)正交试验，共10 组（9 个试验组+1 个对照组），试验分组如表1 所示。9 个试验组中玉米秸秆占风干物质的比例为94%～98%，使风干物质总量达到100%；发酵物中水分含量，根据设计要求调整至60%～70%。对照组不添加玉米粉、棉粕、氯化钠和植物乳杆菌，仅含有玉米秸秆，并调整水分含量为65%。每组3 个重复，每个重复100 g。将试验组发酵底物混合均匀后，添加0.9%氯化钠及一定量的植物乳杆菌，使物料中植物乳杆菌的活菌数达到1×106CFU/g；混合均匀后装入聚乙烯真空袋中，用真空包装机封口。根据本实验室以前的试验结果，室温下（16～28 ℃）微贮秸秆的发酵时间定为28 d。发酵结束后，取样测定其pH，以pH 为主要指标确定最佳底物配比及水分含量。

表1 微贮玉米秸秆发酵底物的正交试验设计(%)

1.3 菌和酶单独及组合处理玉米秸秆的试验设计

在获得上述最佳发酵底物组成的基础上，共设计四个组。分别为对照组：不添加菌和酶；单菌组：添加植物乳杆菌1×106CFU/g；单酶组：添加的纤维素酶滤纸酶活性为0.1 FPU/g 风干物质；菌酶组合组：植物乳杆菌1×106CFU/g、纤维素酶0.1 FPU/g 风干物质。每组3 个重复，每个重复100 g，将发酵底物混合均匀后放于聚乙烯真空袋中，用真空包装机封口，室温下发酵28 d，28 d 后取样进行感官评定，并进行pH、乳酸菌活菌数、纤维素降解率的测定。

1.4 指标测定

1.4.1 感官评定

感官评定方法参考我国农业农村部下发的《青贮饲料质量评定标准》，如表2 所示，开封时对微贮玉米秸秆的水分含量、色泽、气味和质地等感官指标评定，并测定pH，进行综合评分。

表2 青贮饲料质量评定标准（分）

1.4.2 pH测定

将样品混匀后称取10 g 于250 mL 锥形瓶中，加入90 mL 纯化水，于摇床上180 r/min 振荡20 min，通过定性滤纸过滤，所制备的浸提液采用pHS-3C pH计进行测定。

1.4.3 乳酸菌活菌数测定

将样品混匀后称取2 g 于50 mL 离心管中，加入18 mL灭菌生理盐水，振荡均匀后稀释至100万倍，使用MRS固体培养基在37 ℃培养箱培养48 h。乳酸菌活菌数采用平板计数法进行测定，结果以每克微贮饲料所含的微生物菌落数（CFU/g）的自然对数值（lg）来表示。

1.4.4 纤维素含量的测定

将样品置于65 ℃烘箱，干燥至恒重后，将干燥后的样品用粉碎机进行粉碎并过40 目筛后用自封袋密封保存待测。利用滤袋法，参照Van Soest 等[8]的方法测定样品中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素和半纤维素的含量。

1.5 数据统计及分析

试验数据采用SPSS 26.0 统计软件进行单因素方差分析，并用Duncan’s 法对组间进行多重比较，结果用“平均值±标准差”表示，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 最佳底物配比及水分含量的正交试验结果

以pH 为参照指标进行正交试验分析，由表3 可知，各因素对玉米秸秆微贮pH 影响的主次关系为：C（水分含量）＞A（玉米粉）＞B（棉粕），正交试验得出的最佳组合为A2B2C1，与5 组一致，且5 组pH 显著低于2、3、4 组和对照组（P＜0.05）。因而，玉米秸秆微贮中最佳风干物质的组成为96%玉米秸秆、2%玉米粉、2%棉粕；最佳水分含量为60%。以此为基础，开展下面的试验。

表3 不同比例玉米粉、棉粕、水分含量对微贮28 d玉米秸秆pH的影响

2.2 菌酶复合发酵对玉米秸秆微贮乳酸菌活菌数、pH及感官评定的影响

由表4 可知，与对照组相比，单菌组和菌酶复合组均能显著提高玉米秸秆微贮中的乳酸菌活菌数（P＜0.05）。单菌组、单酶组和菌酶复合组与对照组相比，均能显著降低玉米秸秆微贮的pH，其中菌酶复合组的pH 降至3.88，显著低于其余各组（P＜0.05）。感官评定总评分从高到低依次为：菌酶复合组＞单菌组＞单酶组＞对照组。

表4 发酵28 d各组玉米秸秆微贮乳酸菌活菌数及感官评定

2.3 菌酶复合发酵对微贮玉米秸秆纤维素含量及纤维素降解率的影响

由表5 可知，与对照组和单菌组对比，单酶组和菌酶复合组均可显著降低玉米秸秆的中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、纤维素和半纤维素含量（P＜0.05）。

表5 发酵28 d各组玉米秸秆中纤维素含量（%）

3 讨论

3.1 发酵底物对微贮效果的影响

微贮原料中可溶性碳水化合物（WSC）的含量可影响微贮发酵的效果[9]，由于秸秆中的WSC 含量较低，所以在发酵底物中添加玉米粉可提高原料的初始WSC 含量，为乳酸菌生长提供优质碳源，促进乳酸菌的生长增殖，从而达到降低微贮pH、改善玉米秸秆的微贮效果[10]。棉粕中粗蛋白含量高，可以为微生物的生长和繁殖提供氮源，有利于提高玉米秸秆的发酵品质。本试验中，在玉米秸秆的发酵底物中添加适量的玉米粉和棉粕可显著降低玉米秸秆微贮后的pH，其原因是玉米粉和棉粕提供了充足的能源和氮源，有利于乳酸菌的生长和繁殖。水分含量的高低可直接影响微贮的发酵效果，水分过高容易导致微贮过程中发生腐败，水分过低则不利于微生物生长和秸秆发酵。本试验结果显示水分为60%时微贮效果最好，这与李苗苗等[11]的研究结果一致。

3.2 菌酶复合使用对微贮玉米秸秆中乳酸菌活菌数的影响

乳酸菌是微贮发酵过程中的关键微生物。研究发现，乳酸菌产生的乳酸对微贮玉米秸秆发酵品质具有改善作用，乳酸菌通过产生乳酸提高饲料发酵质量[12]，并且在生长过程中将秸秆中难以被消化吸收的大分子物质和抗营养因子分解转化，形成便于家畜吸收和利用的小分子营养物质，提高秸秆的营养价值[13]。经过风干后的秸秆可利用的营养物质含量低于新鲜秸秆，且表面附着的乳酸菌数量减少，因此进行微贮时加入乳酸菌制剂能够增加发酵初始乳酸菌数目，促进乳酸菌增殖产酸，迅速降低微贮秸秆的pH，抑制霉菌等有害微生物的生长，有效改善微贮发酵品质。纤维素酶能够水解玉米秸秆细胞壁的多糖结构，使之分解为葡萄糖，为微生物的生长繁殖提供丰富碳源，进而增加微贮玉米秸秆中有益微生物菌群的数量[14]。本试验中，单菌组和菌酶复合组发酵28 d 后，乳酸菌活菌数显著高于对照组，且菌酶复合组的乳酸菌数目显著高于单菌组。其原因是，纤维素酶分解秸秆产生的葡萄糖等低分子碳水化合物，为乳酸菌的生长和繁殖提供了充足的能源，提高了发酵秸秆中乳酸菌数量，并降低pH，说明菌酶复合有利于提高发酵秸秆的品质，与青绿饲料的发酵结果一致[15]。

3.3 菌酶复合使用对微贮玉米秸秆pH的影响

pH 是衡量玉米秸秆微贮发酵秸秆品质的一个重要指标，发酵过程中微贮的pH 因乳酸菌大量繁殖产生的乳酸而下降[16]。本试验结果中单菌组、单酶组和菌酶联合组处理的微贮pH 均显著低于对照组，其中菌酶复合组的微贮玉米秸秆中pH 最低。乳酸菌是微贮发酵是否成功的关键，底物中添加的玉米粉，可被乳酸菌利用产生有机酸，使微贮的pH 显著降低。纤维素酶的添加可以破坏细胞壁中纤维结构，并在进行微贮时将纤维素转化为葡萄糖，可作为乳酸菌的发酵底物，促进乳酸的产生，降低发酵后的pH[16]。这也是为什么菌酶联合组pH 显著降低及发酵效果好和评分高的原因[17]。

3.4 菌酶复合使用对微贮玉米秸秆中纤维素含量的影响

本研究结果证明，添加纤维素酶的两组均能显著降低玉米秸秆的NDF、ADF和纤维素及半纤维素的含量。其主要原因是在微贮过程中添加纤维素酶所致，与前人研究结果一致[18]。因此，在未来的秸秆微贮中，为了提高微贮秸秆的品质，考虑纤维素酶及其与乳酸菌的共同添加。

4 结论

玉米秸秆微贮发酵风干底物的组成为玉米秸秆96%、玉米粉2%、棉粕2%，水分含量为60%时，微贮发酵效果最好；在此基础上进行菌酶复合常温微贮28 d 后，显著提高了玉米秸秆的发酵品质，证明了纤维素酶与植物乳杆菌在微贮玉米秸秆中的叠加功能，有利于优质微贮玉米秸秆的生产,但菌酶组合微贮玉米秸秆在反刍动物生产中的应用效果还有待进一步探究。