■ 刘建慧 马思雯 张永明,* 王 茜 赵雪城 张凯凯 胡 伟
(1.内蒙古师范大学,内蒙古呼和浩特 010000;2.内蒙古大溪生物科技有限公司,内蒙古呼和浩特 010000)
牛肉是人们特别喜爱的肉类食物之一,由于牛肉具有独特鲜美的口感,含有充足的蛋白质,分解出的氨基酸与人体的需求比较接近,对人体有很好的促进康复和保健的功效,在日常生活中深受大家的青睐。若病牛的肉和血清被当作食物和生物辅料,会严重威胁到人类健康。
牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea, BVD)是通过一种牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染的传染性疾病,也是妨碍母牛正常繁殖,感染各年龄阶段牛的呼吸消化系统并造成损伤的一种免疫抑制疾病[1]。该病最早发生于美国,典型症状是腹泻,其他症状有高热、萎靡不振、厌食、流鼻涕和唾液增多等。作为牛或其他动物的常见疾病,BVDV的传染方式种类繁多,可通过接触病牛而被感染,也可通过环境污染,使牛或者其他动物的呼吸道和消化道被感染[2]。BVDV 不是只存在牛群中,它还可以感染猪[3]、骆驼及其他反刍动物[4]。牛病毒性腹泻病呈世界流行性分布,一旦发病会给牛场带来极大的经济损失。
牛病毒性腹泻的病原也可称为牛病毒性腹泻-黏膜 病 病 毒(bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)[5]。该病毒为直径40~65 nm 的粒状球形,且只有一个病毒髓核,髓核的直径为24~30 nm。BVDV属于基因组长12.3~12.5 kb的单股正链RNA病毒,由一个开放阅读框(ORF),5’-UTR 和3’-UTR 构成。不同BVDV毒株的5’-UTR 基因序列有高度的保守性,根据其基因序列的不同BVDV 可分为1 型和2型,到现在为止,1 型BVDV 已有22 个基因亚型(1a~1v),2 型BVDV 有4 个基因亚型(2a~2d)[6]。BVDV 对外部环境抵抗力很弱,但在低温的条件下仍具有一定的稳定性,在真空且冻干后放于-60~-70 ℃可以保留数年,在26~37 ℃能够保存24 h,但是大部分病毒都丧失了活性,在56 ℃下几分钟内就能完全丧失活性[7]。
BVDV 有两种生物型,分别是致细胞病变型(CP)和非致细胞病变型(NCP)。BVD-MD 的持续性感染主要是由非致细胞病变性毒株引起的,且致细胞病变毒株一般不会引起持续感染,目前的BVD-MD 疫苗株大部分都是致细胞病变株。
牛病毒性腹泻病的传染源是病畜和带毒的动物,其排出的粪、尿等排泄物及精液等均可致病,其他致病因素还有血液、流产胎儿等[8],如果不及时发现并采取措施,可能会造成畜牧场病毒大面积暴发。该病还可以经过牛的口、呼吸道和消化道感染,病畜通过咳嗽使空气中带病毒,使其他动物被传染。病毒还可以通过牛的胎盘发生垂直式感染[9],此时胎儿没有任何免疫能力,导致病毒在体内繁殖,携带病毒直至死亡,且死亡后需要立即进行无害化处理以切断传播途径。也可由带毒者的排泄物等引起水平式传播感染。本病的传播方法有直接和间接两种,一般自然潜伏2~14 d,分为急性感染和慢性感染两种。病毒也存在于雄性牛的精液中,以自然或人工受精两种方式向母牛传播。
该病易感染不同品种、不同年龄的牛,而且肉牛相对于奶牛更易被感染;除在牛群里传播外,也会感染绵羊、山羊、羊驼和猪等家畜及骆驼等反刍动物、鹿和袋鼠等其他野生动物。
BVDV 现已在世界各地存在并传播,呈现一种全球化的趋势,一般流行方式有地方性和季节性。地方性表现在:在畜牧业发达的国家较易发生,也会在封闭式的养殖场突然暴发,一般多呈现隐性感染的状况。季节性表现在:一年四季都实际存在,以春秋两季多见。BVDV 自然感染的情况每年都会发生[10],各个年龄阶段牛的易感率和患病率不同,6 个月以下的小牛患病率低,是因为母源抗体的存在;8~24 月龄患病最常见;3~18 个月龄的牛犊具有很高的易感性,临床表现也较好;其他年龄阶段的牛感染一般为隐性感染。此病的发病率约为5%,死亡率超过90%。
BVD 第一次出现于1946 年的北美洲地区,且于1971年被正式命名。我国出现BVD 是由于1980年自国外引进牛并将病毒带入,由于管控不当对家畜和其他野生动物造成了不同程度的感染[11]。我国学者随后开始对该病毒的研究,李佑民等[12]在1983首次分离并且鉴定到毒株。紧接着大量研究人员开始调查研究发现,感染BVDV 的省市有20多个[13]。到现在为止BVDV感染情况日益扩大。
该病的临床表现有腹泻、发热、黏膜糜烂、萎靡不振、厌食、免疫力低、白细胞数量下降和母牛繁殖受阻等,其严重程度与病程、发病时长和是否继发感染密切相关,一般1~14 d为牛群自然感染潜伏期,14~21 d是牛群人工感染潜伏期[14]。可将BVDV 感染后分为亚临床感染、急性感染、持续性感染和黏膜病等类型[15]。
亚临床感染为自然情况下的一般类型。通过研究发现,人工感染牛身后出现发热现象,但持续时间不超过2 d,在感染后的第13 天,淋巴组织未检测到抗原[16]。该感染类型也从侧面解释了畜牧场的牛群虽然未接种疫苗,但仍能从体内检测到BVDV 抗体。总之,该类型感染后临床症状并不明显,但奶牛有特殊的症状,其产奶量会有下降趋势。
大多数BVDV 感染后的类型为急性感染。BVDV的两种生物类型即NCP 型和CP 型均会引起急性感染,其NCP 型在感染中占主导地位[17]。急性感染牛表现为高热、腹泻、黏膜溃烂、免疫系统受到抑制、血小板和白细胞减少和繁殖障碍等症状[18]。感染牛症状的轻重由病毒毒力决定,与病牛自身的免疫系统状态相关,也会受到环境因素的影响。急性型大部分是被同一种BVDV 反复感染所致,犊牛和免疫系统健全的育成牛急性感染率较高[19]。
持续感染(PI)是最特别的一类,在妊娠期(第45~130 天)母牛接触并感染NCP 型BVDV,病毒越过母体胎盘的保护屏障使腹中的胎儿致病[20],期间可能有流产等征兆。这类胎儿出生后就成了终生带毒和散播病毒的牛[21],简称为持续感染牛(PI牛)。引起PI牛感染的原因是小牛胎儿免疫系统没有发育完全,病毒在胎儿体内不断传播感染,形成持续感染的BVDV[22],导致体内不能有效识别和清除病毒。CP 型和NCP 型BVDV 均可透过胎盘渠道感染新生胎儿,但是前者可由胎儿免疫系统清除,后者则在体内持续感染[23],且两者之间可互相转换。由于体质独特,PI牛在饲养场中里成为了很大的致病源。因此,对于PI牛的发现和及时清除可降低BVDV感染率。
黏膜病是临床上最可怕的一种类型,发病率约为5%,一旦发病死亡机率趋近于100%[24]。病牛症状表现为体温较高、呼吸急促、粪便带血、呼出的气味极臭、胃黏膜和肠黏膜大面积溃疡糜烂等[25]。另外,黏膜病还会造成血液中白细胞数量和血小板均会减少,引起免疫抑制,从而极易被其他病原感染。
初步诊断可以根据临床表现和流行病学来判断,如果想要进一步确诊,可以采用血清学试验、病毒分离和PCR 技术等手段。这些检测方法各有各的优缺点,可根据试验条件和成本考虑,从中选择最优的检测方法。
研究牛BVD,血清学试验是一项十分重要的检测方法与手段。常用的方法有中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫琼脂扩散、免疫过氧化物酶技术(IPT)和蛋白A 胶体免疫电镜技术。其中中和试验是实验室常规使用的方法之一,但是有部分局限性,即疑似牛不能确诊,达不到完全清除病牛的目的。
ELISA 是经典的测试方法,也是一种主要的诊断方法。此方法简单快速,特异性良好,但是在制备抗原中存在较大的困难和挑战,并且在检测抗体时对于PI牛等各种因素都很难被检测到,有时还会出现假阳性等问题,这些方面需进一步改进[26]。免疫琼脂扩散法一般常用于兽医部门检测,有简单方便、具有群特异性等优点,但是准确性不高,敏感性低于中和试验。IPT 现在被应用于抗原的总体分布检测和抗体检测,实验期间可以用显微镜观察细胞的颜色进行判断,是诊断BVDV 比较准确的方法之一。蛋白A 胶体免疫电镜技术是采用电镜观察法,观察病毒的形态,这种方法的缺点是寻找病毒颗粒时会受到相似形态颗粒的干扰,不适合大量样本的筛选。
病毒分离法可以应用于胎牛肾(MDBK)细胞、肺原代细胞的检验,小犊牛的睾丸细胞也很容易被病毒感染[27],最常用细胞MDBK 细胞分离病毒[28]。根据病毒分离选择的结构组织,把动物的组织病料进行研磨和无菌处理后,再接种到对BVDV敏感的细胞上,70 h后观察是否有BVDV 的特征性病变,从而判断此牛是否患有该病[29]。但是这种方法既耗时又耗费精力,有些病毒的分离率也比较低,对于大规模的检测并不适用。
聚合酶链式反应(PCR)是生物体外进行的DNA扩增反应,具有快速、特异性强、敏感度高、模板取材、可扩增mRNA 等特点,可使需要的基因片段大量扩增。PCR 技术检验是核酸对病毒病原体进行检测和鉴定的一种方法,操作简单方便,反应快速灵敏,但实验过程中存在样品污染导致假阳性的出现,也有突变率较高的病毒易出现假阴性的情况[30]。近年来不断发展的荧光定量PCR技术是一种新检验技术,其将传统的PCR与荧光检测方法进行结合检测,这种方法是对需检测的样品中的特定DNA 序列处理,然后对其进行荧光定量分析。陈其兵等[32]根据BVDV的5'UTR保守序列设计特异性引物和探针,从而去优化建立了荧光定量PCR 检测方法。与RT-PCR 检测方法相比,它具有操作简单方便、自动化程度高、高灵敏度、特异性更强、结果可观、重复性好等优点,而且还能有效降低污染风险,对BVDV 也能进行早期的诊断与判断[31],及时发现病原,并能快速准确地实施检测,现已成为检测病原的重要手段。但这种方法对机器要求高。还有一种LAMP 检测方法,是应用核酸新型检测技术,主要观察反应过程中生成的白色沉淀焦磷酸镁。此方法简单方便、反应快速、灵敏度高、特异性强、实验结果显著,但是对引物要求比较高和严格[33]。
牛病毒性腹泻病与牛群的环境卫生以及养殖户的饲养管理密切相关,因此,为了预防这种疾病的蔓延,必须采用综合性预防与治疗措施,包括消毒与卫生管理、疫苗接种、严格的检疫,以及提高饲养管理水平及淘汰持续性感染牛等。
在日常饲养中应定期清扫牛棚,并选择合适的消毒药剂与消毒药品进行消毒处理,从而切断感染和传播途径[34]。同时也要及时消灭、驱除养殖场的蚊、鼠及其他有害动物,以预防中间宿主的感染。
临床试验表明,根据本地区养殖场牛病毒性腹泻流行病学的实际情况,针对性接种牛病毒性弱毒疫苗和猪瘟兔化弱毒疫苗等,可以高效地预防BVDV 感染。其中6~8 个月犊牛期是牛病毒性腹泻极易感染的时期,这时犊牛的抵抗力比较差,并且牛乳中所含母源抗体含量下降,应当根据要求及时进行安全、高效的减毒或弱毒性疫苗的接种[35]。
牛场必须建立健全卫生检疫体系,定期监测牛群的病毒性腹泻病毒,规范养殖户的引种行为,避免不同来源的动物在同一个圈舍中饲养[36],一旦发现BVDV 感染牛,立刻进行隔离处理,要进行无害化处理,避免疾病在牛群中的传播与感染。严禁从疫区进口牛,且牛只买卖、运输时要加强隔离,防止该病毒的扩散与传播。对于进口肉类、乳制品、生物制品也要严格隔离,进一步阻断传染[37]。
养殖户在饲养中要增强对饲料的管控,各年龄段的奶牛都要供应平衡的营养饲料,禁止喂食霉变的饲料,也要注意维生素的补充,提高牛群的身体免疫力,同时要强化养殖场的卫生和水源管理,定期清除水体中的细菌,减少BVDV感染的可能性。
PI牛是BVDV 最大的传染源,在诊治过程中要早期筛查发现并淘汰,这一措施对本病的防控具有重要的意义。这是对BVDV 进行有效地控制与净化的最佳办法,是保障牛群长期安全的重要手段。
疫苗也是很重要的一环,要积极鼓励,研究院所和科研单位、牛场进行BVDV 疫苗的研制工作。现疫苗有两类,分别为BVDV 弱毒疫苗和BVDV 灭活疫苗。前者能够产生较强的免疫力,但个别疫苗株对后代有不良影响及疾病缺陷;后者的安全性高,但效力不如前者。近年来,生物信息技术迅猛发展,出现了一种新的疫苗研发手段,即多表位基因疫苗,与其他疫苗相比,此疫苗具有稳定性高、生物安全性高、过敏率低和方便合成等特点[38]。灭活疫苗的制备一般是通过悬浮培养工艺完成,同时发现反应器规模化制备可以作为未来疫苗发展的主要方向[39]。
总之,BVD是一种常见的传染性疾病。在防控牛BVD 时要遵守防大于治的原则,从源头上遏制其蔓延,一旦发现可疑病例,应马上进行隔离。另外,在对该疾病进行诊断的过程中,要根据临床表现和流行病学特点制订相应的对策,以提高治疗效果。养殖户必须高度重视对该病的诊断和治疗,做好后续的预防工作,制订科学的免疫计划,并采取相应的预防和治疗措施以降低患病率。