一株大黄鱼源乳酸菌的分离鉴定和抑菌分析

范正利，梁倩蓉

（1.温州市渔业技术推广站，浙江 温州 325000；2.浙江省水产技术推广总站，浙江 杭州 310023）

大黄鱼养殖周期长，养殖各阶段会暴发各类病害。病害一旦发生，往往在短时间内出现鱼迅速传染和死亡。多年来，抗生素在预防及治疗大黄鱼细菌性疾病方面发挥着不可替代的重要作用。然而，抗生素的大量使用会导致产生耐药菌株、破坏微生态平衡、抑制免疫系统等诸多弊端，甚至会在水产品中产生药物残留。因此，加强抗生素替代品尤其是抗菌益生菌的创新研究更为重要。本研究通过健康大黄鱼肠道分离益生菌、16S rDNA 基因序列分析结合生理生化鉴定，以杀香鱼假单胞菌为指示菌评估抑菌效果，以期为大黄鱼细菌性疾病治疗与绿色防控提供参考。

一、材料与方法

1.材料

(1)样品。在温州洞头、瑞安、平阳、苍南4 个区域大黄鱼养殖基地各随机抽取5 尾近期未使用抗生素的健康大黄鱼，体长29～32 厘米，体重450～500克，冰鲜保存带至实验室。

(2)试剂与仪器。MRS 琼脂培养基、NA 培养基、LB 固体培养基、LB 液体培养基、牛津杯(8 毫米)均购自青岛海博生物技术有限公司；生理氯化钠溶液，购自四川科伦药业股份有限公司；PCR试剂，购自北京全式金生物技术有限公司；此外还有低温离心机(德国贺默HERMLE)、落地式垂直超净工作台(上海苏坤实业有限公司)、生化恒温培养箱、立式高温灭菌锅(上海博讯实业有限公司)、显微镜(德国蔡司ZEISS)、全自动微生物鉴定仪(法国梅里埃)、紫外分光光度计(上海仪电)、游标卡尺(绿林)。

2.大黄鱼肠道益生菌的分离和纯化

取大黄鱼样品收集肠道3 厘米，置于装有600 毫升无菌水(ddH2O)的1.5 毫升已灭菌EP 管中，研磨棒研磨匀浆。取100 毫升涂布MRS 固体培养基、芽孢杆菌培养基，37℃恒温培养24 小时后，挑取单个菌落进一步划线纯化。将纯化培养基编号进行保存。

3.大黄鱼源益生菌的革兰氏染色和生化鉴定

将分离纯化的菌株挑单个菌落，转移至LB 培养基传代培养和相应孵育。挑取纯化培养后的单菌落，均匀涂布于含有一滴生理盐水的载玻片中央，经火焰固定，进行结晶紫染色、碘染、酒精脱色和蕃红复染后用光学显微镜观察分析。同时将3 毫升无菌盐水加入一个透明的塑料试管(12 毫米×75毫米)中。挑取纯化单个菌落，置于塑料管中制成菌悬液0.5～0.63麦氏单位浊度。根据革兰氏染色结果，将菌悬液和对应的阳性或者阴性细菌鉴定(GN)卡放入全自动微生物鉴定仪卡架中，参照法国梅里埃全自动细菌鉴定仪使用手册，按相关操作进行鉴定。

4.大黄鱼源益生菌的分子鉴定

选取纯化培养基的单个菌落，制备菌悬液，采用热裂解法分离纯化得到细菌DNA 提取，以DNA作为模板，选择细菌16S rRNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对16S rRNA 基因序列进行PCR 扩增。测序结果采用BLAST 细菌数据库进行比对后，选取得分最高、序列一致性在99%以上的已知细菌种类确定为目标物种。

5.牛津杯法抑菌实验

提前制备好LB固体培养基放4℃冰箱备用，以LB 液体培养基+0.2%的琼脂粉制备半固体培养基。将新培养的指示剂菌液(杀香鱼假单胞菌)测定OD 600 值，稀释到107cfu/毫升。120 毫升LB 半固体培养基灭菌后再加3 毫升指示菌菌液(107cfu/毫升)，倒于固体培养基上，制成LB 双层平板。待LB 双层平板培养基上层半固体培养基凝固后，用无菌镊子夹取无菌牛津杯(直径8毫米)等距离置于双层平板上。向牛津杯中注入待测的乳酸菌液、恩诺沙星(0.125～1 微克/毫升)、褐藻寡糖(2.5～20 毫克/毫升)各100 微升，设置阴性对照CK(LB 液体培养基)。室温静置2 小时，转28℃，培养16 小时，观察记录抑菌圈直径。每组设置3个平行。

二、结果

1.分离菌革兰氏染色与特征

在培养基表面可看到白色圆形菌落，表面凸起、边缘完整有光泽且光滑；革兰氏染色结果显示，分离菌株为红色革兰氏阴性球形菌，将分离菌株命名为LAB202301。

2.分离菌生理生化特征

基于VTTEK 2 的64 个生化反应的分析提示，分离菌LAB202301 呈苦杏仁苷、β-半乳糖吡喃糖苷酶、D-半乳糖、蔗糖、乙酰-D-氨基葡萄糖、新生霉素耐受等阳性，鉴定结果为戊糖片球菌，其具体生理生化特性见表1。

表1 分离菌生理性状

3.分离菌分子鉴定

用细菌16S rDNA 通用引物对LAB202301 菌株的基因进行PCR 扩增，得到长度为1451 bp 的片段。序列经NCBI 上BLAST 比对分析后，与戊糖片球菌同源性均在99%以上。综合上述形态学特征、生理生化鉴定及16S rDNA 基因序列比对结果，鉴定分离菌LAB202301为乳酸菌戊糖片球菌。

4.分离菌的抑菌效果

LAB202301乳酸菌菌液、抗生素及寡糖对大黄鱼内脏白点病致病菌杀香鱼假单胞菌具显著的抑菌效果，抑菌直径见表2。结果显示恩诺沙星、寡糖的浓度越高，抑菌效果越好。乳酸菌菌液的抑菌效果优于1 微克/毫升抗生素，但两者不存在显著性差异(P＞0.05)。乳酸菌的抑菌效果虽不如20、10毫克/毫升寡糖，两者也不存在显著性差异(P＞0.05)。乳酸菌的抑菌效果优于其他浓度抗生素，且存在显著性差异(P＜0.05)。R1乳酸菌的抑菌效果优于5 毫克/毫升寡糖，但两者不存在显著性差异(P＞0.05)。R1乳酸菌菌液的抑菌效果显著优于2.5毫克/毫升寡糖(P＜0.05)。

三、讨论

乳酸菌是主要的益生菌之一，在食品、饲料及动保产品等多个方面广泛应用。鱼通过对水环境或饲料中乳酸菌的摄取，并定殖于消化道内与其他有益菌形成优势菌群，共同抑制致病菌繁殖，可有效改善鱼肠道的微生态平衡。

本研究通过分离大黄鱼肠道内的乳酸菌，筛选了一株具有明显抑制杀香鱼假单胞菌的乳酸菌菌株，经过16S rRNA 分子鉴定及生理生化鉴定后确定为戊糖片球菌。该菌株与抗生素、褐藻寡糖对杀香鱼假单胞菌的抑菌效果比较可知，能够有效抑制和杀灭杀香鱼假单胞菌，具有良好的防治大黄鱼内脏白点病的应用潜力。同时，益生菌通过竞争作用抑制有害菌的生长，对病原菌不会产生耐药性，也不会对水产品造成药物残留。研究结果可进一步证实鱼的肠道中存在着具有高活性抑制致病菌的有益乳酸菌，完全可以作为一种水产养殖病害绿色防控的有效手段，可作为抗生素替代品。下一步可以以乳酸菌戊糖片球菌展开相关饲料发酵工艺、致病菌攻毒试验，研究乳酸菌预防与治疗效果、养殖生产示范应用推广等，以更好地将大黄鱼源乳酸菌戊糖片球菌实际应用于预防和治疗大黄鱼内脏白点病。