心脏死亡器官捐献供肾零点活检冷冻组织改良PAS、Masson和PASM染色技术

陈 昕,黄海建,王 晨,陈 新,陈惠玉

随着国际标准化心脏死亡器官捐献(donation after cardiac death, DCD)工作的广泛开展,DCD来源的供肾在临床的应用逐渐增多。DCD供肾移植术后并发症亦呈逐渐增加趋势,如移植肾缺血再灌注损伤、机会性病毒感染、排斥反应等,这就要求临床医师评估供肾质量,除了临床评分及肉眼评估外,肾移植术中零点穿刺标本是评估移植肾功能、预测器官分配或远期存活的金标准[1]。目前大多数肾移植中心常规使用冷冻切片HE染色评估供肾功能状态。由于冷冻制片HE染色存在较多不足,如不能很好地观察肾小球硬化及血管硬化,尤其是制片过程中形成的间质增宽假象,使得供肾评估存在重复性较差、评分不准确等,导致丢弃肾脏或无法预测移植后肾功能。作者通过对DCD来源的供肾穿刺组织行冷冻切片的改良PAS、Masson、PASM特殊染色[2],缩短操作流程,保证在较短时间内完成染色,使得供肾质量在较短时间内得以较准确地评估,介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2021年3月～2022年2月福建省立医院获得的DCD供肾合计45例。本实验经医院伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器樱花OCT冷冻胶世泰玻片(磨砂片),AAF固定液(95%乙醇85 mL、冰醋酸5 mL、40%甲醛10 mL),3%高碘酸,六胺银工作液(蒸馏水20 mL、3%六次甲基四胺水10 mL、5%四硼酸钠2.5 mL、5%硝酸银0.6 mL),0.25%硫代硫酸钠,0.2%氯化金,Harrias苏木精,各级梯度乙醇,二甲苯;PAS试剂盒(迈新公司),Masson试剂盒(贝索生物公司);德国Leica CM1950恒温冰冻切片机。

1.3 方法改良PAS染色步骤[3]:(1)3 μm厚冷冻切片,AAF液固定30 s;(2)高碘酸氧化10 min,蒸馏水冲洗;(3)滴加Schiff液暗处50 ℃烤箱孵育10 min,流水冲洗5 min;(4)苏木精衬染30 s,流水返染;(5)梯度乙醇脱水,二甲苯透明干燥,中性树胶封固。

改良Masson染色步骤[4]:(1)3 μm厚冷冻切片,AAF液固定30 s;(2)Weigert铁苏木精(Weigert铁苏木精A、B液等比例混合液)染5～10 min,流水稍洗;(3)1%盐酸乙醇分化数秒,流水冲洗数分钟;(4)丽春红酸性品红染液65 ℃烤箱孵育10～15 min,流水稍冲洗;(5)磷钼酸溶液处理2～3 min,倾去玻片上磷钼酸溶液(无需水洗);(6)苯胺蓝染液复染3～5 min,倾去玻片上染液(无需水洗);(7)1%冰醋酸水溶液(1%冰醋酸水溶液配制:99 mL蒸馏水+1 mL冰醋酸)冲洗切片至切片无蓝色脱出(必要时镜下控制);(8)95%乙醇稍洗,无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

改良PASM染色步骤[5-7]:(1)3 μm厚冷冻切片,AAF液固定30 s;(2)3%高碘酸氧化10～15 min,流水稍洗;(3)2%硫酸铁铵媒染5 min,蒸馏水洗;(4)浸入85 ℃预热的六胺银工作液中15～20 min至组织达到着色标准,蒸馏水速洗2次终止染色;(5)0.25%硫代硫酸钠1 min,水洗;(6)Harrias苏木精衬染30 s,流水返染;(7)梯度乙醇脱水,二甲苯透明干燥,中性树胶封固。

2 结果

45例肾移植穿刺组织改良PAS染色呈紫红色,清晰染色肾小球囊壁、系膜细胞、基膜以及血管(图1)。在肾小球硬化中呈深紫红色(图2),肾小球入球小动脉可见淡粉色空泡状,显示内膜水肿变性(图3)。45例肾移植穿刺组织改良Masson染色示,基膜、系膜基质和胶原呈蓝色,免疫复合物、纤维素样坏死、血栓均呈红色颗粒状、球形(图4);细胞核呈蓝黑色。肾小管上皮细胞坏死呈颗粒状紫红色、细胞轮廓不清,细胞核结构不清(图5)。45例肾移植穿刺组织改良PASM染色示毛细血管基膜呈黑色,细胞核呈蓝色,红细胞呈红色。通过六胺银染色可以更清晰地显示基膜病变与细胞外基质增多,肾小球硬化及间质纤维化时呈现网线状黑色着色(图6)。

图1 肾小球囊壁、系膜细胞、基膜、肾小管周基膜均呈紫红色染色,PAS染色 图2 肾小球硬化,PAS染色 图3 肾小球入球小动脉硬化,间质较多炎症细胞浸润,PAS染色 图4 肾小球血管襻内微血栓形成,Masson染色 图5 肾小管上皮细胞崩解、颗粒状变性、坏死,Masson染色 图6 肾小球纤维性新月体,伴硬化,PASM染色

3 讨论

由于供肾零点活检只能在供肾从供体取下后移植到受者体内非常短暂的数小时窗口期内进行,故尽可能快速获得组织病理结果尤为重要。冷冻诊断虽然快,但与常规HE染色相比,存在染色对比度较低,组织细微变化易被忽略;而对于供肾零点活检,肾小球硬化率、间质纤维化、血管内膜增厚等形态学特征是评估供肾质量及移植预后的关键,特殊染色则能补充以上冷冻诊断的不足,满足医师对这些变化的观察[2]。

PAS染色是肾脏病理诊断、分类和临床治疗的重要参考依据,其能较好地勾画出肾小球、肾小管基膜的轮廓和肾脏各固有细胞的种类,清晰地显示出肾小球系膜细胞及基质增生的情况、肾小管萎缩状态、血管壁增厚与否及炎细胞浸润的严重程度等,是肾脏病理诊断必要的特殊染色技术[3]。在冷冻中由于时效性的要求,实验将滴加Schiff液的待检片放入烤箱暗处加热孵育,加快染色速度。化学反应的速度大多随温度升高而加快,温度升高时活化分子增加,分子运动加快,反应物分子间的有效碰撞机会增加。糖原染色积分均数随温度升高依次增加,说明多糖类或糖原的乙二醇经过碘酸氧化成双醛基后,后者与Schiff液作用由无色品红变成紫红色化合物速度也加快[8]。

在肾活检组织样本中,Masson染色显示基膜、系膜基质和胶原呈绿色或蓝色(取决于使用亮绿或苯胺蓝),免疫复合物、纤维素样坏死、血栓均呈红色,细胞核呈蓝黑色。主要用于观察坏死性病变、免疫复合物沉积及胶原纤维增生[9]。染色注意要点:固定时间需延长10 min,Masson染色成败与组织固定的关系较大,包括固定液的选择与固定时间的长短。本组冷冻固定液选择的是AAF液,内含甲醛、冰醋酸、95%乙醇,能够很好地固定组织。在PAS、PASM、Masson染色中,相同的固定时间PAS、PASM染色效果较理想,Masson染色则存在染色偏淡情况,可能与固定时间较短有关,作者尝试延长固定时间,丽春红酸性品红加温染色,减少染色水洗时间与磷钼酸分化时间,切片染色得到改善,达到满足诊断的要求。

由于改进前PASM染色耗时较长,约2 h,无法满足快速诊断的需要,所以在工作中未予以开展,但通过改进后染色时间缩短到1 h内,对怀疑供肾有肾小球硬化性肾炎和原发性肾小球肾病等的诊断及预测起到了重要的指导作用[7]。另外,移植标本较小,用冷冻组织做特殊染色可以观察到组织的最大切面,信息含量大,而冷冻组织经脱水后组织缩小20%～30%,再加上常规染色、免疫组化制片损耗较多,信息面不如冷冻活检有优势。本实验改进方法中要注意的问题:(1)冷冻切片厚3 μm,太厚将影响基膜的观察,太薄则延长染色时间。(2)传统氧化使用2%高碘酸,本实验将氧化浓度提高到3%,目的在于使组织内黏多糖更好地暴露出醛基,醛基再把六胺银还原为金属银。(3)传统方法氧化后直接入六胺银工作液,改良后加入硫酸铁铵媒染,使银染更快。(4)提高六胺银工作液中硝酸银的量,由原来的0.5 mL提高到0.6 mL,工作液需新鲜配制,先将3%六次甲基四胺水加入蒸馏水,再加入5%四硼酸钠放烤箱预热10 min,待染色时再加入5%硝酸银,待溶液呈透明状表示配置成功即可使用。四硼酸钠与六次甲基四胺水混合液体碱化后再加入硝酸银,这样可以削弱六次甲基四胺螯合银离子的稳定性,使银离子极易被游离的醛基还原成棕黑色沉淀。(5)孵育温度与时间是染色的关键环节之一,传统染色温度在56～58 ℃染色60～90 min,银染均匀效果好,缺点是耗时。另有文献报道提高工作液染色温度可以缩短染色时间。文献报道[6]90 ℃ 20 min的染色条件亦能达到染色效果,但作者经过实验认为85 ℃染色20 min就可以达到同样染色效果,而且不易出现过度着色现象,基膜染色也较清晰。银染过程中应以肾小球基膜着色强度为终止染色的判断标准,以达到黑色为准,背景应呈黄棕色。这要求技师应关注镜下染色程度,达到染色要求后及时终止染色,避免染色过深,影响观察。