后颅窝室管膜瘤21例临床病理及分子特征

李芷汀,陈 刚,韩 雪,宋国新,刘 冲,潘敏鸿

中枢神经系统肿瘤分类分子信息与实践方法联盟-非WHO官方组织(the Consortium to Inform Molecular Practical Approaches to CNS Tumor Taxonomy- Not Official WHO, cIMPACT-NOW)更新7详细描述了室管膜瘤应按解剖部位和分子或相关的基因改变进行分类[1],WHO(2021)中枢神经系统肿瘤分类基本接纳该内容,根据组织病理学、分子学特征以及解剖部位分为:幕上、后颅窝和脊髓室管膜瘤。后颅窝室管膜瘤又根据基因表达谱及甲基化谱分析进一步分为PFA组和PFB组,两者组织学相似,但在好发人群、临床和预后特点上均不同[2]。本研究回顾总结21例后颅窝室管膜瘤,探讨其临床病理学特征、分子改变及预后,以期提高对该组肿瘤的认识。

1 材料与方法

1.1 临床资料由2名以上高年资病理医师参照WHO(2021)中枢神经系统肿瘤分类诊断标准回顾2014～2023年江苏省人民医院手术获取的914例后颅窝肿瘤,分析其临床、影像及病理资料,补充免疫组化,最终筛选出21例后颅窝室管膜瘤,采用电话或微信交流进行随访。该研究已获得所有患者及其家属知情同意及本单位伦理委员会批准。

1.2 免疫组化标本均经10%中性福尔马林固定,常规脱水包埋,切片,行HE染色,AB-PAS染液购自珠海贝索生物公司;免疫组化染色采用EnVision两步法,一抗包括GFAP、Olig2、EMA、S-100、H3K27me3、D2-40、p53,均购自福州迈新公司,兔单克隆抗体TRPS1(EPR16171,1 ∶8 000稀释)购自Abcam公司。具体操作步骤均严格按试剂盒说明书进行,设立阴性和阳性对照。

1.3 结果判读GFAP、S-100阳性定位于细胞质,EMA、D2-40阳性定位于细胞核旁胞质或胞膜,TRPS1、Olig2、p53、H3K27me3阳性定位于细胞核。GFAP、S-100、EMA、D2-40、Olig2判定方法:采用半定量结果判断,分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。阳性着色细胞数:每张切片上观察5个高倍视野(200×),计数阳性细胞百分比,阳性细胞数<5%为0分,5%～25%为1分,26%～50%2分,51%～75%为3分,76%～100%为4分。阳性着色强度:无阳性着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。两项计分相乘即为阳性等级:0分为阴性(-),1～4分为弱阳性(+),5～8分为阳性(),9～12分为强阳性()。

TRPS1结果判读:根据肿瘤细胞核染色百分比分为0分(<1%),1分(1%～10%)、2分(11%～50%)、3分(51%～100%);根据肿瘤细胞核染色强度记为0分(不着色)、1分(弱染色)、2分(中等染色)、3分(强染色)。两项评分结果相乘作为最终免疫组化评分:0、1分为阴性(-),2分为弱阳性(+),3～4分为阳性(),6～9分为强阳性()[3]。H3K27me3判读标准:超过80%肿瘤细胞核着色视为阳性[4]。p53判读参照胶质瘤,即>10%的瘤细胞p53强阳性等同于TP53突变[5]。

组织学分级为2或3级,但分级标准尚未明确建立,本研究参考Kleinschmidt-DeMasters等[6]提出的分级标准:WHO 2级,核分裂象<5个/10 HPF,不具有明显的核多形性和间变特征、血管内皮增生以及栅栏状坏死;WHO 3级,核分裂象≥5个/10 HPF。

1.4 分子检测H3F3A、异柠檬酸脱氢酶IDH1/2、BRAF基因检测方法为DNA测序分析,试剂盒购自上海源奇生物公司。TERT基因体细胞突变检测方法为ADx-ARMS法,试剂盒购自厦门艾德生物公司。FISH检测:1p/19q、BRAF、EGFR探针购自广州安必平医药公司。例21进行基于高通量测序的泛癌种多基因检测,试剂盒购自广州燃石医学检验所,精选520个与癌症发生机制相关及在研或已上市靶向治疗药物密切相关的基因,平均测序深度≥1 000×,主要步骤有DNA提取、文库制备、测序(Illumina平台)、数据分析等,均严格按照说明书进行。

1.5 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,通过Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,将病例按性别、部位、组织学分级(WHO 2/3级)分组,并通过对数秩检验分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征21例后颅窝室管膜瘤中男性12例,女性9例,发病年龄1.5～76岁,中位年龄44.0岁。12例位于第四脑室,3例位于四脑室及桥小脑角区,2例位于第四脑室及小脑,1例位于四脑室及小脑延髓池,1例位于延髓,1例位于四脑室、左桥小脑角区及延髓,1例位于四脑室、小脑蚓部及小脑延髓池。患者临床症状缺乏特异性,多数表现为头痛、头晕,伴或不伴恶心、呕吐,部分为行走不稳、肢体乏力、麻木,病程1周至8年不等,均行肿瘤完整切除术(表1)。

表1 21例后颅窝室管膜瘤临床病理特点

2.2 影像学特征本组14例获得影像资料,头颅MRI多显示为囊实性团片状混杂信号影,呈T1等-低信号,T2高信号,1例示气泡状混杂信号影,2例可见肿瘤疝入椎管,4例伸入延髓,5例可见压迫周围脑组织、四脑室。增强多呈不均匀强化。1例CT示明显钙化。

2.3 病理检查眼观:送检物多为灰红、灰白色碎组织,质软,少数病例可见显著出血、坏死。镜检:均见肿瘤细胞于血管周围形成假菊形团(图1),6例可见真菊形团及室管膜裂隙,亦可见乳头状(乳头表面光滑、核下方缺乏基膜)、假乳头状(乳头表面参差不齐)、弥漫实性、小簇状排列。值得注意的是,本组6例可见筛网状、腺样、微囊样结构,占肿瘤成分10%～80%。腔隙为大小不等的圆形、不规则形,腔缘表面未见红染的基膜,内见均质嗜酸性分泌物,少数腔内空淡透明或少许絮状物,腔内衬单层立方上皮,无明显异型性(图2～4)。4例可见胞质透明、核偏位的印戒样细胞(图5),2例可见局灶少突胶质样细胞(oligodendrocyte like cell, OLC)。1例可见长梭形似毛发样细胞。绝大部分核较一致,圆形、卵圆形,核分裂象1～10个/10 HPF。1例复发病例少数核多形性,核巨大,分叶状;1例广泛显著核多形性,奇异核、巨型核伴核内假包涵体(图6)。间质血管壁玻璃样变性或血管瘤样,6例见坏死,4例见钙化砂砾体,3例见黏液变性,2例见Rosenthal纤维及嗜酸性颗粒小体。组织学分级:WHO 2级16例(76.2%),WHO 3级5例(23.8%)。免疫表型:GFAP、S-100均弥漫阳性,EMA不同程度核旁点状阳性(20/21),印戒样细胞呈胞膜环状阳性(图7);D2-40核旁点状或胞质阳性(7/7);Olig2阴性。PFB组H3K27me3表达超过80%(20/21),PFA组H3K27me3表达缺失1例(血管内皮细胞核对照阳性),TRPS1核强阳性(10/20)(图8),p53强阳性1例(1/21)(图9),Ki-67增殖指数2%～30%。嗜酸性分泌物PAS、AB-PAS染色均阳性(6/6)(图10)。分子遗传学:21例H3F3A、BRAF、IDH1/2均为野生型。WHO 3级病例检测TERT启动子为野生型、EGFR无扩增,BRAF(2例)无断裂重组,1p/19q(具有OLC的2例)无联合缺失。例21二代测序检测到TP53基因第5号外显子发生体系错义突变,突变丰度94.84%,为TP53基因功能缺失性变异,肿瘤突变负荷低,微卫星稳定。

图1 肿瘤细胞呈放射状排列于血管周围形成假菊形团 图2 部分病例可见筛网状结构,腔内空淡透明或少许絮状物 图3 部分病例可见腺样、微囊样结构,腔内见均质嗜酸性球状分泌物 图4 部分病例显示腺腔内及间质内片状嗜酸性分泌物 图5 部分病例瘤细胞呈胞质透明,核偏位的印戒样细胞 图6 例21瘤细胞核显著多形性,见奇异核、巨型核伴核内假包涵体 图7 具有嗜酸性分泌物的病例,瘤细胞EMA核旁点状阳性,印戒样细胞呈胞膜环状阳性,EnVision法 图8 肿瘤细胞TRPS1核强阳性,EnVision法 图9 例21肿瘤细胞p53核强阳性,EnVision法 图10 腺腔内及间质内嗜酸性分泌物PAS染色阳性

2.4 随访本组中3例失访,余18例随访时间4.0～230.0个月,平均66.6个月,Kaplan-Meier分析显示,平均总生存期为180.6个月,平均无进展生存期为91.2个月,5年总生存率100%,10年总生存率83.3%。性别、部位、组织学分级、有无嗜酸性分泌物与患者生存期无相关性。

3 讨论

根据DNA甲基化和转录谱将后颅窝室管膜瘤分为PFA组和PFB组,PFA组主要发生于婴幼儿,中位年龄2.5岁,常位于四脑室侧方及顶部[7-8];而PFB组主要发生于年龄较大的儿童和成人,中位年龄20.0岁,常见于四脑室中线部位和底部[9];临床表现主要与肿瘤的占位效应和继发性梗阻性脑积水有关[10]。本研究PFB组占绝对优势,与本院患者成人为主要构成有关。

肿瘤通常境界清楚,几乎总是可以找到典型的血管周围假菊形团,其它结构包括室管膜真菊形团、乳头状、假乳头状、室管膜裂隙等。瘤细胞中等大小,圆形或卵圆形,胞质中等、嗜酸性,少数呈巨细胞、黑色素性、印戒细胞样[11]。高级别特征包括核分裂活跃及微血管增生,但基于组织学分级对肿瘤预后风险分层并无显著意义[12]。值得注意的是,本组6例可见多少不等的腺腔样、筛网状结构,腔内充填均质嗜酸性分泌物,文献报道该形态极其罕见,2020年Ahn等[13]首次报道1例,描述为大片嗜酸性球状结构(eosinophilic globular structures),球状结构周围腔隙表面EMA不同程度阳性,PAS及抗淀粉酶均阳性,超微结构显示形态与人胎儿连合下器中的分泌颗粒/分泌囊泡相似。连合下器具有特定的分泌型室管膜细胞,其分泌产物由耐淀粉酶PAS阳性的高分子量唾液酸糖蛋白构成,其不凝结的特性使其保持可溶性进入第三脑室,并进入脑脊液循环。Ahn等认为此形态可能与脑室壁内具有分泌功能的特定起源部位对应。本组6例中嗜酸性物质与文献报道的嗜酸性球状结构可能为同一种物质,可能提示室管膜瘤存在一个具有分泌能力的新亚群,肿瘤内可见典型的血管周围假菊形团,可能代表该腔隙结构为肿瘤的分化,而非独立的肿瘤实体。该形态结构与患者预后及无进展生存期无相关性。

免疫表型方面,肿瘤细胞GFAP弥漫强阳性,EMA、D2-40核旁点状阳性,D2-40、annexin-1及EMA联合应用是诊断室管膜肿瘤的有效方法[14]。Olig2多阴性,少数病例也可见表达[15]。H3K27me3染色可将绝大多数后颅窝室管膜瘤分为PFA和PFB组,其敏感性达99%,精确度达100%[4]。在PFA组H3K27me3完全缺失(注意血管内皮细胞核对照阳性)[8]。Fischer等[16]认为TRPS1可能在室管膜下瘤的发生发展中具有重要作用,其中报道了2例常染色体显性遗传性TRPS1伴室管膜下瘤的患者,说明TRPS1基因改变至少在小部分室管膜下瘤中起致病作用。而室管膜瘤中未见报道,本组21例免疫组化10例强阳性表达TRPS1,可能提示室管膜瘤中也存在与TRPS1相关的基因突变,然其详尽机制需待今后积累更多病例行分子检测进一步研究证实。

TP53突变可见于多种脑肿瘤,但在室管膜瘤中罕见,仅个别研究描述了室管膜瘤携带TP53基因胚系突变[17]。涉及后颅窝室管膜瘤的Li-Fraumeni综合征仅1例,该例TP53第7号外显子242号密码子突变,该位点在各物种均高度保守,也是涉及家族性遗传性肿瘤最常见的突变位点,由于腺嘌呤取代鸟嘌呤,导致酪氨酸取代半胱氨酸残基,且该患者父系、母系均有年轻时死于不同恶性肿瘤的亲属[18]。本组例21有甲状腺癌和肾上腺皮质腺瘤病史,我们曾怀疑其是否为Li-Fraumeni综合征的不典型表现,经二代测序提示为TP53体系突变,患者家族史无异常,不能归类于Li-Fraumeni综合征。

本组病例具有特殊的病理形态,主要需与以下肿瘤鉴别:(1)伴BCOR内部串联重复的中枢神经系统肿瘤:常见于儿童,以大脑半球、小脑半球多见,镜下由卵圆形或梭形细胞组成,常见室管膜瘤样假菊形团、致密的毛细血管网、黏液变性或微囊;免疫组化广泛表达vimentin、CD56,部分细胞表达Olig2、NeuN,常不表达GFAP,分子遗传学特征为BCOR基因第15号外显子3’端发生内部串联重复[19]。(2)伴有多形性和假乳头状特征的高级别胶质瘤:肿瘤局限性生长,形态学可与星形母细胞瘤、室管膜瘤等相似,瘤细胞核的多形性,通常伴有巨细胞形态和多核,瘤细胞黏附性差,常形成假乳头状结构,与例21易混淆,免疫组化标记CD34通常膜质阳性,GFAP、Olig2、EMA等均不同程度阳性,分子遗传学高频出现13号染色体丢失,常见TP53、RB1、NF1、NF2突变[20]。(3)卵黄囊瘤:镜下可呈筛网状、微囊样、腺样、乳头状结构,瘤细胞异型明显,Schiller-Duval小体是其典型特征,免疫组化常表达SALL4、OCT3/4、Glypican-3等[21]。(4)分泌性脑膜瘤:肿瘤细胞内见局灶腺样分化伴PAS阳性的嗜酸性分泌物,为一种假砂砾体,免疫组化表达CEA、EMA,分子遗传学KLF4和TRAF7突变[22]。(5)转移性腺癌:尤其是乳腺癌、肺腺癌、甲状腺癌等,腺腔内均可有嗜酸性分泌物,瘤细胞异型明显,免疫组化可表达TRPS1、TTF-1、NapsinA等,临床肿瘤病史可鉴别[23]。

后颅窝室管膜瘤PFA组预后较差,10年生存率为56%,患者复发率和转移率更高,PFB组预后较好,疾病进展少见。手术切除范围也是决定室管膜瘤生存率的重要指标,完全切除的PFA组患者5年无进展及总生存率为18%和52%。由于PFA组肿瘤部分位于桥小脑角三角区侧,导致整体切除率下降,总生存率低下;而PFB组较容易完整切除,5年无进展及总生存率为90%和100%[7]。

综上所述,后颅窝室管膜瘤组织学出现广泛嗜酸性分泌物的组织学变异时,应仔细寻找经典的血管周围假菊形团、室管膜菊形团,认识该形态结构变异,有助于与其他原发性脑肿瘤或转移瘤鉴别,减少误诊,本研究还注意到,TRPS1可能在室管膜瘤的发生发展中起作用,本组1例伴瘤细胞核的显著多形性、巨细胞,检测到TP53突变,增加了对该组肿瘤的认识。