推拿对膝关节骨关节炎模型大鼠膝关节软骨白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子受体相关因子6、细胞核因子信使核糖核酸携带遗传信息及蛋白的影响

罗 翱，余 敏*，杜曜宇，郭 啸，喻溢楠

（1.重庆市北碚区中医院，重庆 400700；2.重庆医科大学中医药学院，重庆 401331）

膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以关节周围骨增生为主要表现的关节疾病，其特征是膝关节软骨退行性变化导致软骨丢失和破坏[1]。常伴有关节滑膜继发性炎症病变，又称退行性关节炎、增殖性关节炎和老年性关节炎等，临床表现为关节疼痛、绞杀、功能障碍[2-3]。目前，对于KOA 患者，临床上主要采用药物治疗为主，非药物治疗为辅的治疗原则[4]。然而，有研究显示，西医常规治疗KOA 疗效不佳，药物副作用显著，例如，广泛使用非甾体抗炎药和糖皮质激素有许多副作用，影响患者的依从性，从而影响其实际疗效[5]。因此，寻求一种经济、环保、适用范围广、易于操作、接受度高的非药物治疗方法对KOA 患者来说是非常紧迫的[6]。基于此，本实验通过选择12 周龄雄性美国斯泼累格·多雷（SD）大鼠27 只，通过动物实验，分析推拿对膝骨性关节炎可能的生物学机制，现做出如下阐述。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择12 周龄雄性SD 大鼠27 只，体质量400～450 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，采用随机数字表法选取9 只作为正常对照组（n=9），余下18只II 型胶原酶诱导建立KOA 大鼠模型，再利用随机数字表将其分为自然恢复组（n=9）和推拿手法治疗组（n=9），正常对照组于造模前一天取标本；自然恢复组正常喂养并于第1 次造模后4 周处死大鼠取标本。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备 将Ⅱ型胶原蛋白酶注入SD 大鼠膝关节腔内，1 周后镜下观察，关节组织有早期KOA 样改变说明大鼠KOA 模型制备成功。实验选用美国Sigma 公司Ⅱ型胶原蛋白酶，用无菌生理盐水将胶原蛋白酶粉末溶解配成浓度为0.02 mg/50 μL（≥25 CDU/50 μL）的溶液备用。实验步骤：①将大鼠称重，用新鲜配置的质量浓度为2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠；②将双侧膝关节用碘伏消毒3 次；③用1 mL 注射器行右膝关节穿刺，回抽未见血液回流后将50 μL 配置好的胶原蛋白酶注入关节腔内；④退针后予碘伏棉签按压擦洗伤口，并用敷帖覆盖伤口，术后不给予其他特殊处理。

1.2.2 饲养环境 饲养室的消毒隔离工作是管理中重要的一环，必须引起高度重视，其是保持大鼠等级的关键。饲养员进入饲养室前必须更衣，以肥皂水洗手并用清水冲洗干净，戴上消毒过的口罩、帽子、手套后方可进入；饲养室内保持整洁，门窗、墙壁、地面、鼠盒、架子每天擦洗；每周二、周五用0.1%新洁尔灭或其他消毒剂消毒，隔周更换消毒剂品种，每月进行1 次大消毒，用0.1%过氧乙酸喷雾消毒效果较好。

1.2.3 干预措施 ①2%戊比妥钠（上海新亚药业有限公司，国药准字H31021725，规格：0.1 g）注射麻醉造模成功后待干预大鼠（40 mg/kg）。②肌群推拿法：将大鼠仰卧位，造模侧腘窝部垫少量棉花使膝关节微屈，术者立于患侧，针对大腿及小腿肌群采用推、揉、点等方法推揉相关肌肉群，强化肌肉力量。包括大鼠大腿的股四头肌、股二头肌、半腱肌、大收肌、缝降肌和小腿的腓肠肌、腓骨长肌、胫骨前肌等，施术约3 min；③肌腱、韧带弹拨法：术者以大拇指指腹弹、拨、揉相关肌腱及韧带：重点为②中所述肌群在膝关节附近的肌腱及膝关节两侧副韧带、冠状韧带，时间约2 min。④揉髌法：术者以拇食二指按住髌骨，以较轻手法按揉髌骨1 min。⑤手指点穴法：点按大鼠梁丘、血海、阴陵泉、阳陵泉、委中、三阴交、足三里每穴各5 次。⑥关节牵引、旋转法：将大鼠侧卧，90°屈膝患肢，术者右手握紧大鼠小腿近踝端，左手抵住大鼠大腿远端近腘窝处，术者双手相向用力牵引大鼠膝关节，并做顺时针和逆时针小幅度旋摇膝关节，施术约1 min。⑦放松手法：术者在其膝关节周围采用双指叠擦法，以透热为度，时长1 min，结束手法。1 次/d。

1.3 观察指标①比较造模4 周后3 组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 相对表达量；②比较造模4 周后3 组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白表达水平。

表1 3 组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 相对表达量比较（±s）

表1 3 组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 相对表达量比较（±s）

IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6；TRAF6：肿瘤坏死因子受体相关因子6；NF-κBp65：细胞核因子；mRNA：信使核糖核酸携带遗传信息。

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表2 3 组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白的水平比较（pg/mL，±s）

表2 3 组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白的水平比较（pg/mL，±s）

IL-1β：白介素-1β；IL-6：白介素-6；TRAF6：肿瘤坏死因子受体相关因子6；NF-κBp65：细胞核因子。

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IL-1β、IL-6、TRAF6 的检测方法：开放大鼠左冠状动脉前降支，从右外静脉通道采集2 mL 血液，3 000 r/min 速度离心10 min，使用双抗体夹心法结合酶标仪（上海闪谱生物科技公司，型号：SuPerMax 3100）对上述指标的相对表达量进行测定。

NF-κBp65 的检测方法：将样品在SDS-PAGE中进行电泳分离，使用半干式电印记法将转移凝胶上蛋白，使用5%脱脂乳进行封闭90 min，再洗涤3 次，每次持续10～15 min，在一抗工作液中孵育90 min，通过ECL 显色法，将β-actin蛋白作为内参蛋白，使用Imagine-J 分析蛋白灰度比值，表示目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学分析采用SPSS20.0 统计学软件，其中计量资料用（±s）来表示，通过F值进行验算，P＜0.05 代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠的I L-1 β、I L-6、T R A F 6、N FκBp65 mRNA 相对表达量比较正常对照组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-kBp65mRNA 相对表达量低于推拿手法治疗组和自然恢复组（P＜0.05），推拿手法治疗组的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 相对表达量低于自然恢复组（P＜0.05），见表1。

2.23 组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白的水平比较正常对照组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-kBp65 蛋白水平低于推拿手法治疗组和自然恢复组（P＜0.05），推拿手法治疗组的IL-1β、IL-6、TRAF6、NFκBp65 蛋白水平低于自然恢复组（P＜0.05），见表2。

3 讨论

随着临床中对Toll 样受体4（TLR4）的研究逐渐深入，KOA 患者组织中的TLR4 水平的变化情况受到广泛关注。TLR4 属于Toll 样受体（TLRs）家族中的一员，其属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，被激活后，能够引发较为强烈的免疫反应，在天然免疫以及炎症反应中作用明显[7]。当TLR4 受到激活之后，其能够经过下游的髓样分化因子（MyD88）依赖性信号转导通路使各种炎症因子被激活[8]。MyD88被激活之后，TLR4 可以结合MyD88 Toll 结构，形成串级联反应，然后和TRAF6 相结合，使IkB 激酶复合体被激活[9]。

TRAF6 和许多条滑膜组织的炎症信号通路的活化具有密切联系，其能够对炎症因子的形成以及释放产生调节作用，和破骨细胞的分化、存活以及骨重吸收具有密切联系，并与骨代谢过程、细胞凋亡进程以及应激反应形成过程具有密切联系[10]。本文发现：正常对照组的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-kBP65mRNA 及蛋白相对表达量均低于推拿手法治疗组和自然恢复组（P＜0.05），推拿手法治疗组的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65mRNA 及蛋白相对表达量均低于自然恢复组（P＜0.05），说明KOA 大鼠和正常大鼠相比，上述指标mRNA 以及蛋白表达水平处于高表达状态下，和膝骨性关节炎的发生具有一定联系。NF-kB 和炎症反应、免疫调节、肿瘤形成以及细胞凋亡具有密切关联，从表1 以及表2 中可以发现，膝骨性关节炎大鼠滑膜中的上述指标水平均有所提升，说明该因子的水平和膝骨性关节炎的发生具有一定关联[11]，采用推拿治疗，可将IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65mRNA 以及蛋白水平改善，从而减轻炎性因子水平。

传统中医理论认为，推拿是具有疏通经络、推行气血、扶正祛邪、调和阴阳的一种治病防病的养生术。推拿在本质上是属于以“机械力”为特征，通过作用于局部产生生物力学效应，改善局部组织细胞生化环境，调节循环、神经及内分泌等系统状态的一种物理方法，本文研究结果证明了其效果。

综上所述，推拿可将膝骨性关节炎大鼠滑膜组织的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 以及蛋白水平表达量明显改善，发挥消炎止痛效果，从而预防膝骨性关节炎，值得临床参考。