肌苷对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠的肺保护作用及机制探讨

许弄玉，钟江姗，李多

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是以肺内过度炎症反应和肺泡/毛细血管屏障破坏引起的肺水肿为特征的肺疾病，在危重症患者中具有较高的发病率和病死率［1］。其发病机制复杂，关联多条炎症信号通路，其中核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是最常参与其中的信号通路［2］。因此，抑制NF-κB通路被认为是减弱脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的ALI 产生炎性因子的重要机制之一［3］。多聚ADP 核糖聚合酶［poly（ADP）-ribosepolymerase，PARP］是一种DNA 修复酶，参与细胞分裂、染色体重塑、调控细胞凋亡等重要程序［4］。目前主流观点认为PARP-1与NF-κB之间的相互作用在免疫应答的过程中扮演着重要角色［5］。通过抑制PARP-1 可减少炎性细胞因子的产生，减轻氧化和亚硝化应激，减少线粒体自由基生成和细胞坏死，缓解包括肺［6］、胰腺、肠黏膜［7］在内的多种脏器损伤。肌苷是由腺苷脱氨酶分解腺苷而形成的另一种内源性嘌呤，目前已在神经病变、心血管疾病等多个领域表现出潜在的药理价值［8-9］。同时，大量研究证实肌苷具有强大的免疫调节功能，其在脓毒症、缺血再灌注和炎症损伤的动物模型中均表现出良好的保护作用［10-13］。本研究旨在探讨肌苷在LPS 诱导的大鼠ALI 中对PARP-1 以及Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）4/髓样分化蛋白88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）/NF-κB 细胞信号通路的作用，为临床开展肌苷治疗ALI提供早期理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 20只8周龄SPF级健康雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自西南医科大学动物实验中心，动物生产许可证号：SCXK（川）2018-17。适应性喂养1周后进行实验。

1.1.2 药物及试剂 LPS及肌苷均购自北京索莱宝科技有限公司；PARP-1、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子（TNF）-α 以及白细胞介素（IL）-1β 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自科鹿（武汉）生物科技有限责任公司；TLR4 兔源单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；MYD88、NF-κB p65 及磷酸化（p-）NF-κB p65 兔源单克隆抗体均购自美国CST 公司；GAPDH 兔源单克隆抗体购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自ASPEN公司。

1.1.3 仪器 酶标仪（DR-200Bs，Diatek 公司），冷冻离心机（TGL-16，湖南湘仪实验室仪器），恒温培养箱（GNP9160，上海精宏实验设备有限公司），电泳仪（DYY-6C）、脱色摇床（WD-9405A）购自北京市六一仪器厂，水浴锅（HH-W-600，金坛市江南仪器厂），扫描仪（LiDE110，Canon）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型建立 采用随机数字表法将SD大鼠分为4 组：空白（NC）组、模型（LPS）组、肌苷低剂量干预（INL）组、肌苷高剂量干预（IN-H）组，每组5 只。各组大鼠腹腔注射4%水合氯醛（0.08 mL/kg）充分麻醉后，对LPS 组、IN-L组及IN-H组大鼠气管内滴注LPS（5 mg/kg）制备ALI模型；在相同条件下，NC 组大鼠气管内滴注等体积生理盐水。在建模完成后1、6、12 h 通过腹腔注射的方法分别给予IN-L 和IN-H 组100 和200 mg/kg 肌苷。LPS 组及NC 组在相同时点给予等体积的生理盐水。建模完成后24 h进行后续实验。

1.2.2 动脉血氧分压（PaO2）测定 清理大鼠腹部毛发，剪开皮肤，暴露腹腔，推开肠管后在脊柱前方可见到淡粉色的腹主动脉，用棉签将表面筋膜组织剥离干净，使用肝素化的注射器抽取大鼠腹主动脉血约0.2 mL，进行PaO2检测。

1.2.3 PARP-1、iNOS 及炎性因子的含量测定 抽取大鼠腹主动脉血5 mL；剪开大鼠胸部，暴露气管及双侧肺叶，结扎右侧肺叶，并切开气管，插入气管给药管，将给药管固定后，经气道缓慢注射约3 mL生理盐水进入左侧肺叶，反复抽注5次后收集支气管肺泡灌洗液（BALF）。将取得的血清及BALF样本于3 000 r/min 离心10 min，收集上清液。剔除实验过程中死亡的大鼠，使用ELISA 试剂盒检测PARP-1、iNOS、TNF-α和IL-1β含量。每组重复3次。

1.2.4 肺湿/干质量比测定 剪下右肺上叶组织，漂洗后吸尽表面水分，称质量得肺湿质量（W）；随后将其烘干至彻底脱水，再次称取的质量即为肺干质量（D），计算该样本的湿/干质量比（W/D）。

1.2.5 肺组织形态及病理学观察 剪取大鼠右肺中叶肺组织，冲洗干净后观察肺组织形态，固定，包埋，切片，进行苏木素-伊红（HE）染色。在光学显微镜（×200）下随机读取5个视野进行评分，病理评分标准参考文献［14］，取各视野评分平均值作为每个样本的肺损伤病理学评分。

1.2.6 肺组织中蛋白表达检测 排除实验过程中死亡的大鼠，每组取3 个右肺下叶标本进行TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的检测。将标本漂洗干净后制成匀浆液，反复吹打后离心，取上清液测定蛋白总浓度，根据样品浓度确定上样量，保证每个样品总蛋白上样量相同。按浓缩胶80 V、分离胶120 V 进行恒压电泳、300 mA 恒流转膜。将转好的膜室温封闭1 h，除去封闭液后加入一抗4 ℃过夜。回收一抗，洗涤后加入二抗，室温孵育30 min。滴加增强型化学发光试剂（ECL）混合溶液到膜的蛋白面侧，随后在暗室中曝光，根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC 软件处理系统分析目标条带的光密度（OD）值。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0 软件进行数据分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较方差齐则采用LSD-t检验，方差不齐则采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 NC 组大鼠一般情况良好，正常饮水进食，呼吸平稳（50～70次/min），可正常活动，无脱发、毛发暗淡、精神萎靡等表现。LPS组活动明显减少，表现出反应迟钝、食欲不振、呼吸急促（100～120次/min）、毛发暗淡。IN-L组则较LPS组活动、进食、对刺激反应等均有好转，呼吸频率有所下降（80～100 次/min）。IN-H 组的呼吸频率与IN-L 组相比又略有下降（60～90次/min）。

2.2 大鼠肺脏大体变化 NC 组肺脏外形饱满，呈浅粉色，包膜完整，弹性可，未见充血、水肿、淤斑等。LPS 组肺脏体积稍缩小，表面充血，呈暗红色，包膜下可见大片淤斑及片状出血。IN-L 组肺脏体积较LPS 组稍有增大，表面仍充血，颜色深红，薄膜下淤斑及出血灶有所减少。IN-H组体积接近正常肺脏，颜色浅红，淤斑、充血、水肿明显减少。见图1。

Fig.1 Macroscopic observation of rat lung tissue图1 大鼠肺组织肉眼观察

2.3 大鼠肺损伤病理学评分、PaO2、W/D 比较 HE染色结果显示，LPS组大鼠肺组织结构明显被破坏，肺泡间隔显著增厚，肺泡可见大面积水肿、充血，伴有炎性细胞的广泛浸润，大鼠肺损伤病理学评分较NC 组升高（P＜0.05）；而IN-L 组及IN-H 组中肺组织结构较LPS 组明显清晰，浸润的红细胞及炎性细胞减少，肺泡间隔缩小，病理评分下降，且IN-H组病理学评分较IN-L 组下降更明显（均P＜0.05），见图2、表1。与NC组相比，LPS组大鼠PaO2大幅下降，出现严重的低氧血症，而不同剂量的肌苷可显著改善大鼠低氧血症，其中IN-H 组较IN-L 组的改善作用更加明显（P＜0.05），见表1。LPS组肺W/D较NC组明显升高，IN-L 组W/D 较LPS 组下降，IN-H 组较IN-L组下降（均P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of lung injury pathological scores,lung W/D,and PaO2 of rats between the four groups表1 4组大鼠肺损伤病理学评分、动脉血PaO2、肺W/D比较（n=4，）

Tab.1 Comparison of lung injury pathological scores,lung W/D,and PaO2 of rats between the four groups表1 4组大鼠肺损伤病理学评分、动脉血PaO2、肺W/D比较（n=4，）

＊＊P＜0.01；a与NC 组比较，b与LPS 组比较，c与IN-L 组比较，P＜0.05；表2、3同；1 mmHg=0.133 kPa。

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Fig.2 HE staining of lung tissue of rats(×200)图2 各组大鼠肺组织HE染色（×200）

2.4 肌苷对PARP-1、iNOS 及炎性因子的影响 与NC 组相比，LPS 组血清及BALF 中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β含量均升高（P＜0.05）。与LPS组相比，IN-L 组和IN-H 组血清及BALF 中PARP-1、iNOS、TNF-α 以及IL-1β 含量均出现降低，且IN-H组下降程度更加明显（均P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of concentrations of PARP-1,iNOS,TNF-α and IL-1β in serum and BALF between the four groups of rats表2 各组大鼠血清和BALF中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β浓度比较（n=3，）

Tab.2 Comparison of concentrations of PARP-1,iNOS,TNF-α and IL-1β in serum and BALF between the four groups of rats表2 各组大鼠血清和BALF中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β浓度比较（n=3，）

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2.5 肌苷对肺组织TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表达的影响 在LPS 组中TLR4、MYD88、p-NF-κB p65 蛋白的表达较NC 组上调（P＜0.05），IN-L 组TLR4、MYD88、p-NF-κB p65 蛋白表达较LPS 组降低，IN-H 组较IN-L 组蛋白表达进一步降低（P＜0.05）；而4 组NF-κB p65 蛋白表达差异均无统计学意义，见图3、表3。

Tab.3 Comparison of the protein levels of TLR4,MYD88,NF-κB p65 and p-NF-κB p65 between the four groups of rats表3 各组大鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平比较（n=3，）

Tab.3 Comparison of the protein levels of TLR4,MYD88,NF-κB p65 and p-NF-κB p65 between the four groups of rats表3 各组大鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平比较（n=3，）

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3 讨论

3.1 LPS 诱导ALI 大鼠模型的建立 ALI 是一种病死率极高的异质性肺疾病，目前的标准疗法，如机械通气、俯卧位和给药神经肌肉阻断剂的治疗效果仍存在一定的限制性［15］。因此，探索治疗ALI 的新药物，总结其药理作用并揭示其潜在的机制具有重要意义。尽管目前ALI已经不再被用作描述人类疾病的术语，但它仍然适用于动物模型［16］。在本研究中气道灌注LPS后大鼠的各项指标均可证实ALI模型构建成功。在使用不同剂量的肌苷干预后，大鼠肺组织病理损伤程度减轻，炎性指标下降，提示肌苷可改善LPS诱导的大鼠ALI。

3.2 肌苷通过调节TLR4/NF- κB 通路改善ALI TLR4/MYD88/NF-κB 信号通路与内脏敏感性、肿瘤、功能性肠病等多种疾病相关，在炎症反应过程中扮演重要角色［17］。TLR4 是TLR 跨膜蛋白家族成员之一，除TLR3 以外的所有TLRs 均可通过MYD88介导激活NF-κB以及产生炎性细胞因子［18］。IL-1β 是IL-1 家族的重要成员之一，可诱导释放多种促炎介质，从而放大最初的炎症反应［19］。TNF-α同样是ALI 中的关键炎性介质，可以刺激产生IL-1β，协同增强IL-1β的作用［20］。在LPS刺激下，激活的TLR4 提高MYD88 衔接蛋白募集，加速NF-κB 核易位，促使TNF-α、IL-1β 等炎性细胞因子释放入血；同时，这些炎性因子也反过来加强NF-κB通路，加重肺组织损伤［21］。

在本研究中，LPS诱导后在大鼠血清和BALF中TNF-α 及IL-1β 含量显著增加，肺组织中TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白表达增加，而分别给予不同剂量肌苷干预后，上述变化均被抑制。Guo 等［13］研究证实肌苷可以通过减少肝细胞中TLR4、MYD88、NF-κB mRNA 等的表达改善LPS 诱导的急性肝损伤，这与本研究得出的结论相符。通过调节TLR4/MYD88/NF-κB 信号通路，肌苷抑制了NF-κB的活化入核，减少TNF-α、IL-1β 炎性介质的释放，从而减轻LPS 诱导的ALI，上述改变在IN-H 组中较IN-L组更为明显，因此在一定范围内更高剂量的肌苷可能起到更好的肺保护作用。

3.3 肌苷对ALI中PARP-1的影响 多聚ADP核糖基化修饰是一种重要的翻译后蛋白质修饰，参与DNA 修复和复制、转录调控及细胞死亡等生理过程，PARP 家族在此过程中发挥主要的作用［22］。其中PARP-1是最典型的PARP家族成员，在人体中发挥着家族90%以上的功能［4］。目前关于PARP-1 对NF-κB 的调节机制主要存在2 种猜测：（1）酶途径。激活的PARP-1可催化NF-κB p65的RelA亚基的糖基化，从而诱导NF-κB转录活性上调和促炎基因表达增加。（2）非酶途径。PARP-1 可以作为对接分子，直接与NF-κB的p65和p50亚基结合［5］。活化的NF-κB 可转录调控iNOS 的基因表达，iNOS 表达的增加可直接导致氧化应激的增强，产生的NO弥散入细胞可抑制线粒体呼吸链，影响能量代谢，进一步加剧组织损伤［23］。

Virág 等［24］研究首次证实肌苷可剂量依赖性地抑制过氧亚硝酸盐处理的巨噬细胞中PARP-1的激活，推测这是因为肌苷与PARP-1 的底物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸拥有部分相似的结构，因此在理论上可能具备抑制PARP-1的效果。本实验中给予不同剂量的肌苷后，大鼠血清以及BALF 中PARP-1 下降，p65 磷酸化及NF-κB p65 的核易位受到抑制，iNOS 含量也出现下降，各项肺损伤指标均有所改善，提示肌苷可以通过对PARP-1 的抑制下调NFκB在肺组织中的表达，从而起到肺保护的作用。

3.4 局限性 目前临床上ALI的标准治疗手段仍是机械通气，但考虑到使用机械通气可能存在加重机械性肺损伤的风险，同时可供参考的文献较少，在相关参数的选择上难度较高，因此在本研究中并未联合机械通气进行治疗。在后续的研究中，可以尝试在机械通气的基础上使用肌苷对ALI 进行干预，为肌苷治疗ALI提供更加有力的实验结论。

综上所述，肌苷对LPS 诱导的大鼠ALI 具有一定的保护作用。其机制可能与下调TLR4/MYD88/NF-κB信号通路，抑制PARP-1活性，减少NF-κB核易位相关。这有望为ALI的临床药物治疗提供更多的参考，但其具体机制以及适用性仍需进一步研究。