红芸豆根腐病拮抗内生细菌的筛选和鉴定

赵 杰 ，田琼金 ，聂蔓茹 ，池吉平 ，马福嵘 ，赵晓军 ，郝晓娟

（1.山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801；2.忻州市农业产业发展中心，山西 忻州 034099）

红芸豆（Phaseolus vulgaris）为豆科菜豆属植物，因其抗旱能力强、生育期短、具有较高的经济价值而成为山西省旱区农业产业结构中一类重要的杂粮[1]。根腐病是影响山西省红芸豆生产的重要因素之一，该病在红芸豆整个生育期均可发生，发病初期，根部和茎基部产生褐色或砖红色斑点，后期病斑连片，发病严重时，地上部枯死，严重影响红芸豆的产量及品质[2]。目前，合理轮作和使用化学药剂是防治红芸豆根腐病的主要措施。比如，播种前可使用50%多菌灵可湿性粉剂拌种或35%多·福·克悬浮种衣剂包衣处理；苗期可使用75%百菌清可湿性粉剂喷雾处理；开花结荚后使用70%甲基托布津可湿性粉剂配成毒土撒于根际表面[3-5]。但长期使用化学药剂会影响土壤微生物多样性，导致农药残留增加，引起环境污染[6]。随着人们对生态环境和食品安全重视度的日益提升，生物防治成为应对植物病害的重要措施之一[7]。

内生细菌是指定殖于健康植物内部，对植物没有危害的细菌[8]。有些内生细菌具有抗菌、促生、与病原菌竞争生态位和营养物质、诱导植物产生抗性等有益生物学作用[9-10]。从土壤中分离筛选到的生防细菌常易受到环境影响而导致防效不稳定，内生细菌由于受到植物组织的保护，对外部环境因素依赖较少，因此，在土传病害生物防治方面倍受关注[11]。从菜豆中分离筛选到的内生拮抗细菌木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）CTA8689 菌株通过生产抗真菌化合物和胞外酶，在离体条件下抑制腐皮镰孢菌菌丝生长和分生孢子萌发，在盆栽试验中对菜豆根腐病的防治效果可达87.60%[12]。内生细菌Herbaspirillum lusitanumP6-12 菌株对根腐病菌具有抑制作用，并且能成功定殖于菜豆体内[13]。王媛媛等[14]从大豆根瘤分离出的内生细菌Snb2 对尖镰孢菌和茄腐镰孢菌具有拮抗作用，对幼苗的生长也有明显的促进作用。韩祥东等[15]从大豆根系分离筛选得到4 株内生细菌，对引起大豆根腐病的疫霉菌菌丝生长具有抑制作用，最高抑制率可达87.10%。张淑梅等[16]从大豆的根、茎、叶和种子中筛选到31 株对大豆根腐病菌具有抑制作用的内生细菌。内生细菌在生物防治方面具有较大的应用潜力。

苍耳是一种传统药用植物，在我国分布广泛。谢仰熹等[17]在苍耳中分离出了8 株内生真菌，对番茄早疫病菌具有良好的抑制效果。苍耳内生放线菌多样性丰富，李凯琴[18]在苍耳中分离出24 株对黑曲霉、稻梨孢菌等病原菌具有拮抗活性的内生链霉菌。目前尚鲜有对苍耳内生细菌的研究报道。

本研究从苍耳中分离筛选对红芸豆根腐病菌具有抑制作用的拮抗内生细菌并对其进行鉴定，同时对筛选出的菌株进行了抑菌作用、抑菌谱和安全性测定，以期为红芸豆根腐病生物防治提供菌种资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物 2022 年7 月从山西农业大学校园采集苍耳植株备用。

1.1.2 供试病原菌 尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）、禾谷镰孢菌（F.graminearum）、厚垣镰孢菌（F.chlamydosporum）、三线镰孢菌（F.tricinctum）、层出镰孢菌（F.proliferatum）、木贼镰孢菌（F.equiseti）、拟轮枝镰孢菌（F.verticillioides）、芬芳镰孢菌（F.redolens）、腐皮镰孢菌（F.solani），由山西农业大学植物保护学院杂粮病害课题组分离保存。

1.1.3 供试培养基 NA 培养基：牛肉浸膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉15 g，pH 值7.0～7.2，蒸馏水1 000 mL；NB 培养基：牛肉浸膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值7.0～7.2；PDA 培养基：新鲜马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 苍耳内生细菌的分离

选取新鲜的苍耳植株，用水洗净，分别称取5 g根、茎、叶组织，置于75%乙醇中浸泡5 min，使用无菌水清洗1 次，再在2.5%次氯酸钠中浸泡3 min，最后用无菌水漂洗3 次。吸取第3 次漂洗液涂布至牛肉膏蛋白胨培养基（NA）上，用于检测组织表面是否消毒彻底。加入10 mL 无菌水对消毒后的组织材料进行研磨并进行梯度稀释，取100 μL 稀释液涂布于NA 平板上，在28 ℃恒温黑暗培养。待长出单菌落后，挑取单菌落进行纯化后转入试管斜面保存。

1.3 红芸豆根腐病拮抗细菌的筛选

以尖镰孢菌（F.oxysporum）为靶标菌，采用平板对峙法筛选拮抗细菌[19]。选取培养5 d 的病原菌平板，使用无菌打孔器在菌落边缘打取直径为6 mm的菌饼，放置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中央。吸取4 μL 内生细菌发酵液接种在距病原菌2 cm滤纸片（直径6 mm）上，每个平板接种4 个点，空白对照为只接种病原菌，每个处理重复3 次，于28 ℃恒温黑暗培养，7 d 后测定菌落直径并计算抑制率。

1.4 xj-1-2 的鉴定

1.4.1 形态鉴定 观察xj-1-2 菌株单菌落形态，进行革兰氏染色。

1.4.2 分子鉴定 使用细菌DNA 基因组提取试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司）进行xj-1-2 菌株基因组DNA 的提取。选择gyrB序列简并引物gyrB-F（TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT）和gyrB-R（TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC）进行PCR 扩增。PCR 扩增体系总体积为25 μL，包括上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，2×Taq Mix 12.5 μL，ddH2O 补足至25 μL。PCR 扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 个循环；72 ℃延伸 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果后，将扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。将测序序列在NCBI 数据库中进行Blast 比对，用Mega 6.0 软件采用比邻法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。

1.5 xj-1-2 对尖镰孢菌菌丝生长的影响

将尖镰孢菌菌饼（6 mm）接种于PDA 培养基中央，在距离菌饼2 cm 处点接xj-1-2，在两者中间，插入灭过菌的盖玻片，以不接种xj-1-2 的尖镰孢菌为对照。28 ℃培养7 d 后，用镊子取出盖玻片，显微镜下观察菌丝形态。

1.6 xj-1-2 对尖镰孢菌孢子萌发的影响

将尖镰孢菌培养5 d 后，往培养皿中加入无菌水，用灭菌涂布器刮下分生孢子，经4 层纱布过滤后得到孢子悬浮液。xj-1-2 于28 ℃，180 r/min NB培养基中培养24 h 后获得发酵液。将等量尖镰孢菌孢子悬浮液和xj-1-2 发酵液混匀后，28 ℃培养，用无菌水代替xj-1-2 发酵液作为对照，每个处理重复3 次。分别在4、6、8 h 镜检，统计孢子总数和萌发孢子数，计算孢子萌发率和抑制率。

1.7 xj-1-2 抑菌谱测定

平板对峙法同1.3，将xj-1-2 菌株与1.1.2 中的8 种供试病原菌进行对峙，每处理设3 个重复，于7 d 时测量菌落直径并计算抑制率。

1.8 xj-1-2 对红芸豆种子萌发的影响

xj-1-2 菌株发酵液制备方法同1.6。发酵液经6 000 r/min 离心5 min，弃上清液，余下部分重悬与无菌水混匀制成菌悬液。将发酵液和菌悬液浓度均稀释至1×107、1×108、1×109cfu/mL 备用。取颗粒饱满均匀的红芸豆种子，自来水冲洗干净，用2%次氯酸钠对红芸豆进行表面消毒3 min，无菌水冲洗3 次，晾干后，分别将已表面消毒的红芸豆浸泡于各稀释梯度的发酵液和菌悬液中5 min，以无菌水浸泡的种子为对照，每皿9 粒，每个处理重复3 次，放置在25 ℃恒温箱中保湿培养，3 d 后测定发芽率、芽长。

1.9 数据分析

利用Microsoft Excel 和SPSS 26.0 软件进行数据统计和差异显著性分析，采用LSD 法进行差异性显著检验。

2 结果与分析

2.1 内生拮抗细菌分离筛选结果

从苍耳根、茎、叶中共分离得到36 株内生细菌，从中筛选出1 株对尖镰孢菌有显著抑制作用的菌株，该菌株编号为xj-1-2（图1），对尖镰孢菌抑制率为64.29%。

图1 内生拮抗细菌筛选结果Fig.1 Screening results of endophytic antagonistic bacteria

2.2 xj-1-2 的鉴定结果

2.2.1 形态学鉴定结果 在NA 培养基上，xj-1-2菌落呈乳白色，不透明，近圆形，表面稍有皱褶，中间部分凹陷呈火山口状，不产色素（图2-A）；革兰氏染色反应为阳性，菌体形态为杆状（图2-B）。

图2 菌株xj-1-2 菌落形态和革兰氏染色反应结果Fig.2 The colony morphology of strain xj-1-2 and result of Gram staining reaction

2.2.2 分子鉴定结果 对xj-1-2 的gyrB基因进行PCR 扩增后得到920 bp 大小的基因序列。同源性比对表明，xj-1-2 与贝莱斯芽孢杆菌（登录号CP050462.1）的相似性为99.78%。系统发育分析表明，xj-1-2 与贝莱斯芽孢杆菌聚为一个分支（图3）。结合形态学与分子鉴定结果，将xj-1-2 鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

2.3 xj-1-2 对尖镰孢菌菌丝生长的影响

对照菌丝呈线状平滑生长，分枝较少（图4-A），与xj-1-2 共培养后，尖镰孢菌菌丝分枝增多（图4-B），生长受到抑制，产孢量减少。

2.4 xj-1-2 对尖镰孢菌孢子萌发的影响

xj-1-2 对尖镰孢菌孢子萌发的影响如表1所示。

表1 xj-1-2 对尖镰孢菌孢子萌发的影响Tab.1 Effect of xj-1-2 on spore germination ofFusarium oxysporum %

由表1 可知，4 h 对照组萌发率为59.34%，而与xj-1-2 共培养的处理组尖镰孢菌孢子没有萌发；8 h对照组萌发率达到97.80%，而处理组萌发率仅为25.87%。4、6、8 h 时对照萌发率均显著高于处理。xj-1-2 对尖镰孢菌孢子萌发抑制率在4、6、8 h 分别为100%、79.45%、73.54%。

2.5 xj-1-2 抑菌谱测定结果

由表2 可知，xj-1-2 对8 种供试病原真菌均有拮抗作用，其中对厚垣镰孢菌（F.chlamydosporum）的抑制作用显著高于其他病原真菌，抑制率为75.59%；对木贼镰孢菌（F.equiseti）的抑制作用相对较差，抑制率为45.13%；对其他6 种病原真菌抑制率均在58.00%以上，说明xj-1-2 抑菌谱较宽，具有开发为生防制剂的潜力。

表2 xj-1-2 抑菌谱测定结果Tab.2 Measurement results of antifungal spectrum of xj-1-2 %

2.6 xj-1-2 对红芸豆种子萌发的影响

由表3 可知，经浓度分别为1×107、1×108、1×109cfu/mL xj-1-2 菌株发酵液和菌悬液处理后的种子与对照相比，发芽率和芽长均无显著差异，即该菌株不影响红芸豆种子萌发和生长。

表3 xj-1-2 对红芸豆种子萌发的影响Tab.3 Effects of xj-1-2 on seed germination of red kidney bean

3 结论与讨论

本研究以红芸豆根腐病病原菌尖镰孢菌为靶标菌，从苍耳中分离筛选到具有拮抗作用的内生细菌菌株xj-1-2，结合形态学以及gyrB基因序列分析，将xj-1-2 鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis），xj-1-2 能导致尖镰孢菌菌丝分枝变多，抑制菌丝生长，降低产孢量和孢子萌发率，从而影响病原菌的生长和繁殖。xj-1-2 对8 种供试病原真菌均有抑制作用，且不影响红芸豆种子萌发，具有进一步开发为生防菌剂的潜力。

贝莱斯芽孢杆菌作为一种生防细菌，已被广泛应用于农作物病害生物防治中。谢海鹏等[20]分离出的贝莱斯芽孢杆菌SD13 菌株对豇豆枯萎病的防治效果达62.0%。张庆琛等[21]从薄荷中分离得到贝莱斯芽孢杆菌X7 菌株，对番茄黄萎病的防效为67.16%。此外，贝莱斯芽孢杆菌对番茄灰霉病菌[22]、棉花黄萎病菌[23]、白菜黑斑病菌[24]、稻瘟病菌[25]、油茶炭疽病菌[26]等均有不同程度的拮抗作用。目前，已有有效成分为贝莱斯芽孢杆菌的制剂，例如，四川百事东旺生物科技公司生产的贝莱斯芽孢杆菌母药和200 亿cfu/g 的水分散粒剂，能够防治黄瓜、烟草的白粉病[27]；华中农业大学研制出的贝莱斯芽孢杆菌CanL-30 可湿性粉剂，能够防治油菜菌核病、黑胫病[28]；加拿大生产的Ataplan 和Arolist 生物杀菌剂，以Bacillus velezensisRTI301 为主要活性成分，可用来防治由镰孢菌引起的玉米、大豆和向日葵根腐病[29]。

贝莱斯芽孢杆菌对病原菌菌丝和孢子萌发均有抑制作用，如刘雪娇等[30]分离出的贝莱斯芽孢杆菌3A3-15 菌株能导致尖镰孢菌菌丝扭曲、膨大、畸形，对孢子萌发抑制率达93.2%。潘梦诗等[31]分离出的贝莱斯芽孢杆菌BS-1 可使花生白绢病菌菌丝分枝增多，顶端膨大，出现断裂。贝莱斯芽孢杆菌GDND-2 发酵滤液可延迟尖镰孢菌孢子萌发2 h 以上，并促使菌丝提早分枝，菌丝产生畸形、皱缩、穿孔、泡囊化等现象[32]。本研究中贝莱斯芽孢杆菌xj-1-2 对尖镰孢菌菌落生长具有明显的抑制作用，可使菌丝分枝变多，与潘梦诗等[31]的研究结果一致，对孢子萌发的抑制作用与多人研究结果[30,32]相同，但未观察到菌丝膨大、畸形、断裂等现象。

贝莱斯芽孢杆菌的生防机理主要包括拮抗作用、竞争作用、诱导植物抗性等[33]。陈爽等[34]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌HM3-3 不但可以诱导大豆体内过氧化物酶、多酚氧化酶等防御酶的活性，还可以通过分泌溶解酶，破坏病原菌的细胞壁。欧婷等[35]对贝莱斯芽孢杆菌SWUJ1 发酵液的抑菌活性物质进行分离纯化，发现该菌株可产生表面活性素、丰原素和伊枯草菌素等脂肽类抗生素。曾欣等[36]分离到的内生贝莱斯芽孢杆菌，能够产生蛋白酶、β-葡聚糖酶、嗜铁素、伊枯草素、泛革素和表面活性素等。本研究获得的贝莱斯芽孢杆菌xj-1-2菌株具有广谱抑菌活性，但对其抑菌机理尚缺乏了解，在后续研究中，将对xj-1-2 菌株的抑菌机理展开深入研究，并对其室内和田间生防效果进行测定。