三肽基肽酶1 和环状RNA Tau-微管蛋白激酶2 在食管癌组织中的表达及与患者预后的关系

薛金良，靳超，张晓

郑州大学附属洛阳中心医院胸外科，洛阳市心胸外科疾病临床研究中心，河南 洛阳 471009

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤，近年来发病率日益增高。据统计，全球每年食管癌病死例数约30 万例，中国约15 万例，约占全球的50%[1]。尽管近年来影像技术、外科手术、放化疗等技术快速发展，但多数患者就诊时仍已处于食管癌晚期，因此，早期诊断、及时治疗是提高食管癌患者预后的关键。相关研究表明，食管癌的发生与相关蛋白的表达密切相关[2]。端粒保护蛋白三肽基肽酶1（tripeptidyl peptidase 1，TPP1）高表达与多种肿瘤细胞的发生、发展、转移密切相关[3]。近年来，相关报道显示，基因转录会形成非编码环状RNA（circular RNA，circRNA）Tau-微管蛋白激酶2（Tau-tubulin kinase 2，TTBK2），其是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移，并诱导细胞凋亡、产生细胞毒性，可作为肿瘤生物学标志[4]。因此，本研究探讨TPP1、circ-TTBK2 在食管癌中的表达及与患者预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年6 月至2017 年6 月郑州大学附属洛阳中心医院收治的食管癌患者。纳入标准：①年龄49～75 岁；②术前未接受化疗、放疗等辅助治疗；③临床资料完整。排除标准：①合并心、肝、肾严重疾病；②合并严重神经功能、认知功能障碍；③依从性差；④合并其他恶性肿瘤。依据纳入和排除标准，本研究共纳入100 例食管癌患者，其中男59 例，女41 例；年龄49～75 岁，平均（59.31±6.65）岁；病理类型：鳞状细胞癌67 例，其他33 例；分化程度：高分化21 例，中分化37 例，低分化42 例。取100 例食管癌患者的食管癌组织及癌旁正常组织。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.2 免疫组化法检测TPP1 蛋白的表达情况

选取100 例食管癌患者的食管癌组织及癌旁正常组织，生理盐水清洗后保存在10%甲醛溶液中，-80 ℃恒温箱保存待检。石蜡切片标本厚2 μm，烘烤60 ℃，二甲苯脱蜡，抗原修复，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次。滴加内源性过氧化物酶，室温孵育15 min，冲洗。滴加一抗（稀释浓度1∶100），室温孵育1 h，冲洗。滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G 聚合物，室温孵育30 min，采用PBS 代替一抗；滴加山羊抗兔二抗室温孵育30 min。二氨基联苯胺显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，树胶封片[5]。结果判定：采用双盲法评估TPP1 蛋白的表达情况[6]。随机选取5 个视野，依据染色强度进行评分：无着色计0 分，浅黄色染色计1 分，棕黄色染色计2 分，棕褐色染色计3分；依据阳性细胞所占比例进行评分：阳性细胞所占比例﹤25%计1分，阳性细胞所占比例为25%～50%计2分，阳性细胞所占比例﹥50%计3分。将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相乘，﹤4分判定为阴性，≥4分判定为阳性。

1.3 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）检测circ-TTBK2 的相对表达量

选取100 例肿瘤组织及癌旁正常组织，生理盐水冲洗后保存于-70 ℃冰箱中待检。采用Trizol 总RNA 提取试剂盒提取总RNA，按逆转录试剂盒说明书将总RNA 逆转录，得到互补DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA 为模板用RT-PCR 试剂盒进行PCR 反应。PCR 反应条件：90 ℃60 s，92 ℃30 s，56 ℃30 s，74 ℃30 s，38 个循环。circ-TTBK2 上游引物：5'-AATAGTACTTGGGTCCTCCTCT-3'，下游引物：5'-CTGCCAACTGTCGCATGTTC-3'；以β-actin为内参，上游引物：5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3'，下游引物：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'。每个标品均设3 个平行反应复孔，参照每孔Ct 值进行分析[7]。计算circ-TTBK2 的相对表达量。

1.4 随访

对所有患者进行为期3 年的随访，随访时间截至2020 年6 月，记录患者的预后情况。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对所有数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；食管癌患者预后的影响因素采用Cox 风险比例回归模型分析；以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TPP1、circ-TTBK2 表达情况的比较

食管癌组织中TPP1 的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，circ-TTBK2 的相对表达量明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表1、图1）

图1 食管癌组织中TPP1蛋白的表达情况（免疫组化染色，×400）

表1 食管癌组织和癌旁正常组织中TPP1、circ-TTBK2表达情况的比较

2.2 不同临床特征食管癌患者食管癌组织中TPP1、circ-TTBK2 表达情况的比较

不同性别、年龄、病理类型食管癌患者食管癌组织中TPP1 蛋白表达情况和circ-TTBK2 相对表达量比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。分化程度为低中分化、有淋巴结转移、TNM 分期为Ⅲ+Ⅳ期、浸润深度为T3～4食管癌患者食管癌组织中TPP1 蛋白阳性表达率分别高于分化程度为高分化、无淋巴结转移、TNM 分期为Ⅰ+Ⅱ期、浸润深度为T1～2的患者，差异均有统计学意义（χ2=28.168、4.345、7.994、6.156，P﹤0.05）。分化程度为低中分化、有淋巴结转移、TNM 分期为Ⅲ+Ⅳ期、浸润深度为T3～4食管癌患者食管癌组织中circ-TTBK2 的相对表达量分别高于分化程度为高分化、无淋巴结转移、TNM 分期为Ⅰ+Ⅱ期、浸润深度为T1～2的患者，差异均有统计学意义（t=6.060、11.721、15.728、11.240，P﹤0.05）。（表2）

表2 不同临床特征食管癌患者食管癌组织中TPP1、circ-TTBK2表达情况（n=100）

2.3 食管癌患者预后影响因素的单因素分析

随访3 年，100 例食管癌患者生存68 例，死亡32 例，病死率为32.00%。年龄、性别、病理类型均可能与食管癌患者的预后无关（P﹥0.05）；分化程度、TNM 分期、浸润深度、淋巴结转移情况、circ-TTBK2 表达情况、TPP1 表达情况均可能与食管癌患者的预后有关（P﹤0.05）。（表3）

表3 食管癌患者预后影响因素的单因素分析

2.4 食管癌患者预后影响因素的多因素分析

将单因素分析中差异有统计学意义的分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移情况、circ-TTBK2表达情况、TPP1 表达情况作为自变量，食管癌患者的预后作为因变量纳入多因素Cox 风险比例回归模型分析，结果显示，浸润深度为T3～4、分化程度为低中分化、TNM 分期为Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移、circ-TTBK2高表达、TPP1蛋白阳性表达均为食管癌患者预后的独立危险因素（P﹤0.05）。（表4）

表4 食管癌患者预后影响因素的Cox 风险比例回归模型分析

3 讨论

有研究显示，肿瘤的发生发展与端粒、端粒酶密切相关[8]。TPP1 表面的TEL patch 与端粒酶结合，可调节端粒酶的募集及活性，进而控制端粒的长度和稳定性，且端粒的改变与乳腺癌、肝癌、神经胶质瘤等多种肿瘤的发生密切相关。既往在宫颈癌细胞中加入端粒酶抑制剂——BIBR1532，可抑制TPP1 上的TEL patch 与端粒酶结合，从而抑制宫颈癌Hela 细胞的生长，并促进其凋亡[9]。Zhang 和Dong[10]对慢性B 淋巴细胞白血病的端粒变化情况进行研究发现，仅TPP1 及复制蛋白AⅠ（replication protein AⅠ，RPAⅠ）的表达明显上调，其他蛋白水平均有降低。Wallace 等[11]采用基因芯片技术检测结肠癌中基因表达情况发现，与正常结肠组织相比，结肠癌组织中TPP1 的表达明显上调，提示TPP1 蛋白阳性表达对结肠癌患者的用药选择有指导意义。

circ-TTBK2 是一种激酶，是神经细胞骨架的主要成分，其通过催化微管中含量最高的Tau 蛋白使微管处于不稳定状态，激活微管磷酸化，通过调节miRNA-217 等通路调控胶质瘤的恶性程度[12]。相关研究发现，circ-TTBK2 在多种恶性肿瘤中过表达，能促进肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭[13]。

本研究结果显示，食管癌组织中TPP1的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，circ-TTBK2 的相对表达量明显高于癌旁正常组织，且随着食管癌临床分期增高、组织分化程度的降低及淋巴结转移情况，TPP1 和circ-TTBK2 的表达也逐渐上调，这与徐勇军等[14]研究食管癌组织中circ-TTBK2 表达情况一致，说明其与食管癌的发生发展密切相关。同时，为明确影响食管癌患者预后的危险因素，本研究对食管癌患者进行为期3年的随访发现，100例患者病死率高达32%。相关研究发现，TPP1表达升高与食管癌患者3 年总生存率降低密切相关[15]。而Zhang等[16]的研究也表示，circ-TTBK2 可作为判断食管癌患者恶性程度与预后的生物学标志物。本研究Cox风险比例回归模型分析结果显示，浸润深度为T3～4、分化程度为低中分化、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移、circ-TTBK2 高表达、TPP1 蛋白阳性表达均为食管癌患者预后的独立危险因素（P﹤0.05）。表明TPP1 和circ-TTBK2 均与食管癌患者的预后关系密切，进一步提示TPP1 和circ-TTBK2 可通过参与肿瘤细胞的分化、浸润和转移影响食管癌患者的临床结局，但关于其以何种方式来调节食管癌的进展仍未明确，后续仍将继续深入研究。

综上所述，TPP1 在食管癌中阳性表达，circ-TTBK2 在食管癌中高表达，且与食管癌患者的临床特征密切相关，circ-TTBK2 高表达、TPP1 蛋白阳性表达均为食管癌患者预后的独立危险因素。