叉头框蛋白P3 在乳腺癌放疗患者中的表达及临床意义△

张志宇，白静，白雪峰，孙金霞，陈盛清，孔祥虎

1内蒙古科技大学包头医学院研究生院，内蒙古 包头 014040 包头市肿瘤医院2放射治疗科，3病理科，内蒙古 包头 014030

统计数据显示，2021 年全球乳腺癌新发病例230.9 万例，成为全球最常见的恶性肿瘤，死亡例数居全球女性恶性肿瘤首位[1]。放疗作为乳腺癌术后辅助治疗的重要手段，可以显著降低乳腺癌术后局部复发和远处转移风险[2]。放射抵抗是影响乳腺癌术后辅助放疗疗效的主要原因之一[3]。降低放射抵抗性，增加放疗敏感性，对于降低乳腺癌术后局部复发率、提高患者生存率具有重要意义。因此，寻找可预测放疗敏感性的新指标，既有助于找到放疗增敏靶点，为放疗增敏药物的研发寻找最可能的获益人群，又可指导临床医师制订合理的个体化放疗方案，提高不同亚型乳腺癌的放疗效果。叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）对调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）的发育和免疫抑制功能起到至关重要的作用，其在不同类型肿瘤细胞中有不同程度的表达，可影响肿瘤细胞的增殖、迁移等，在乳腺癌中是重要的肿瘤抑制基因[4]，但其与放疗疗效的关系鲜有报道。本研究分析FOXP3 在乳腺癌放疗患者中的表达及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年1 月至2018 年12 月包头市肿瘤医院收治的乳腺癌患者。纳入标准：①经病理检查首次确诊为浸润性乳腺癌；②行改良根治术、调强放射治疗和术后辅助化疗；③均为女性。排除标准：①术前接受过化疗、内分泌治疗、免疫治疗及靶向治疗；②合并其他系统恶性肿瘤；③临床资料不完整。依据纳入和排除标准，本研究共纳入90例乳腺癌患者。另选取于包头市肿瘤医院经病理检查确诊的30 例乳腺纤维腺病患者。乳腺癌患者和乳腺纤维腺病患者的年龄分别为（42.5±6.9）岁和（44.3±8.2）岁，两组比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意。

1.2 免疫组化染色法检测FOXP3 表达

将石蜡包埋的乳腺癌组织和乳腺纤维腺病组织标本进行4 μm连续切片，然后二甲苯脱蜡，95%、75%梯度乙醇水化，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次。高压修复抗原，PBS冲洗3次，应用免疫组化笔固定边缘，双氧水封闭，加入稀释的兔抗人单克隆抗体FOXP3（1∶100），放在湿盒内，4 ℃孵育过夜。PBS 冲洗3 次，滴加酶标记的二抗试剂后，将湿盒置于室温孵育，PBS冲洗3次，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察。

1.3 免疫组化染色结果判定

FOXP3 主要定位于细胞核，随机选取5 个高倍视野，每个视野计数100 个细胞。由病理科2 位副主任医师依据染色强度和阳性细胞所占比例进行评分，意见不统一时共同商讨决定最终结果。染色强度评分：无色计0 分，淡黄色计1 分，黄色计2分，棕黄色计3 分；阳性细胞所占比例评分：≤5%计0 分，6%～25%计1 分，26%～50%计2 分，﹥50%计3分。染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，≥4 分为阳性，﹤4 分为阴性。

1.4 疗效评价

将改良根治术和辅助放疗后的局部失败视为对放疗反应不佳（放疗敏感性差）。放疗结束3 个月后，胸壁、锁骨、腋窝淋巴结引流区肿瘤复发或部分肿瘤组织仍残留，定义为局部失败，再结合影像学和病理学检查结果进行局部失败的诊断[5]。局部失败率=局部失败例数/总例数×100%。

1.5 随访方法

所有患者均进行随访，随访内容包括体格检查、影像学检查、实验室检查，随访截止时间为2022 年2 月。前2 年每3 个月随访1 次，第3 年每半年随访1 次，之后每年随访1 次。无病生存期（disease-free survival，DFS）定义为手术开始至肿瘤复发、转移，或由于任何原因导致患者死亡的时间。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；采用Logistic 回归模型分析乳腺癌患者中FOXP3阳性表达的影响因素，结果用校正后的优势比（odds ratio，OR）和与之相应的95%置信区间（confidence interval，CI）表示；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank 检验；采用Cox比例风险模型分析乳腺癌放疗患者DFS的影响因素。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织和乳腺纤维腺病组织中FOXP3 表达情况的比较

乳腺癌组织中FOXP3 阳性表达率为38.9%（35/90），明显低于乳腺纤维腺病组织的76.7%（23/30），差异有统计学意义（χ2=12.859，P=0.001）。（图1）

2.2 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中FOXP3 表达情况的比较

不同临床分期、孕激素受体（progesterone receptor，PR）表达情况、Ki-67表达情况、淋巴结转移情况乳腺癌患者乳腺癌组织中FOXP3表达情况比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。不同肿瘤最大径、年龄、绝经情况、生育次数、雌激素受体（estrogen receptor，ER）表达情况、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表达情况、p53 表达情况、组织学分级、脉管侵犯情况和神经侵犯情况乳腺癌患者乳腺癌组织中FOXP3 表达情况比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中FOXP3 表达情况的比较

2.3 乳腺癌患者中FOXP3 阳性表达影响因素的多因素Logistic 回归分析

以2.2 中差异有统计学意义的因素作为自变量，乳腺癌患者中FOXP3阳性表达为因变量进行多因素Logistic 回归分析，结果显示，临床分期、Ki-67表达情况、淋巴结转移情况均是乳腺癌患者中FOXP3阳性表达的独立影响因素（P﹤0.05）。（表2）

表2 乳腺癌患者中FOXP3 阳性表达影响因素的多因素Logistic 回归分析

2.4 不同分子分型乳腺癌患者乳腺癌组织中FOXP3 表达情况的比较

Luminal A 型乳腺癌患者乳腺癌组织中FOXP3 阳性表达率高于Luminal B 型、三阴性、HER2 过表达型乳腺癌患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。Luminal B 型、三阴性、HER2 过表达型乳腺癌患者FOXP3 阳性表达率两两比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表3）

表3 不同分子分型乳腺癌患者乳腺癌组织中FOXP3 阳性表达情况的比较[n（%）]

2.5 不同FOXP3 表达情况乳腺癌患者放疗疗效的比较

FOXP3 阳性表达乳腺癌患者的局部失败率为2.9%（1/35），明显低于FOXP3阴性表达患者的25.5%（14/55），差异有统计学意义（χ2=7.864，P=0.005）。

2.6 不同FOXP3表达情况乳腺癌放疗患者DFS的比较

90 例乳腺癌患者的随访时间为5～68 个月，中位随访时间为47 个月，在随访期内，15 例患者复发，中位DFS 为60.31 个月，1 年无病生存率为95.6%，3 年无病生存率为88.2%，5 年无病生存率为72.3%。FOXP3 阳性表达乳腺癌患者的1、3、5年无病生存率分别为100%、100%、95.7%，FOXP3阴性表达乳腺癌患者的1、3、5 年无病生存率分别为94.5%、81.4%、38.6%，FOXP3 阳性表达乳腺癌患者的DFS 明显优于FOXP3 阴性表达患者，差异有统计学意义（χ2=9.753，P=0.002）（图2）。

图2 FOXP3阳性表达（n=35）和FOXP3阴性表达（n=55）乳腺癌放疗患者的DFS曲线

2.7 乳腺癌放疗患者DFS 影响因素的单因素和多因素分析

单因素分析显示，乳腺癌放疗患者的DFS 可能与肿瘤最大径、临床分期、年龄、绝经情况、PR 表达情况、Ki-67 表达情况、组织学分级、脉管侵犯情况、神经侵犯情况和淋巴结转移情况无关（P﹥0.05），可能与分子分型、ER 表达情况、HER2 表达情况、FOXP3 表达情况有关（P﹤0.05）。以单因素分析中差异有统计学意义的因素作为自变量，乳腺癌放疗患者的DFS 作为因变量进行Cox 比例风险回归分析，结果显示，FOXP3 阳性表达、ER 阳性表达均是乳腺癌放疗患者DFS 的独立保护因素（P﹤0.05）。（表4、表5）

表4 乳腺癌放疗患者DFS 影响因素的单因素分析

表5 乳腺癌放疗患者DFS 影响因素的Cox 多因素回归分析

3 讨论

放疗是乳腺癌的重要治疗手段，可以明显提高患者术后局部控制率，但也存在一些因素影响放疗疗效和预后[6]。通过检测某些标志物可以预测乳腺癌放疗敏感性和放疗疗效。乳腺癌精准放疗的实施与患者的分子分型、基因组型及放疗敏感性密切相关，个体化精准放疗可通过联合靶向药物、放射增敏剂或改进放疗技术，提高放疗疗效，减少乳腺癌复发和转移，提高局部控制率，延长DFS。因此通过检测相关蛋白的表达预测放疗敏感性，并以此为依据对乳腺癌患者制订个体化放疗方案，提高乳腺癌患者的放疗疗效是临床研究的热点。

McInnes 等[7]在BT549 乳腺癌细胞系中发现，FOXP3 可以通过直接与SATB 同源框蛋白1（SATB homeobox 1，SATB1）基因启动子结合抑制SATB1基因表达或是通过促进微小RNA（microRNA，miRNA）-7 及miRNA-155 的表达沉默该基因，从而发挥抑癌作用。本研究结果显示，乳腺癌组织中FOXP3 阳性表达率为38.9%，明显低于乳腺纤维腺病组织的76.7%，差异有统计学意义（P﹤0.01），说明FOXP3 具有抑癌作用，能够抑制乳腺癌的发生。多因素Logistic 回归分析结果显示，临床分期、Ki-67 表达情况、淋巴结转移情况均是乳腺癌患者中FOXP3 阳性表达的独立影响因素（P﹤0.05），临床分期越低、Ki-67 表达水平越低，乳腺癌患者中FOXP3 阳性表达率就越高，无淋巴结转移乳腺癌患者中FOXP3 阳性表达率高于有淋巴结转移患者。Lee 等[8]研究了不同分子分型乳腺癌对电离辐射的敏感性，结果表明，Luminal A 型乳腺癌细胞株的放射敏感性最强，HER2 过表达型乳腺癌细胞株具有辐射抵抗性，三阴性乳腺癌细胞株最耐辐射。本研究发现，Luminal A 型乳腺癌患者乳腺癌组织中FOXP3 阳性表达率高于Luminal B 型、三阴性、HER2 过表达型乳腺癌患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05），表明Luminal A 型乳腺癌患者中FOXP3 阳性表达率较高。Li 等[9]研究表明，FOXP3可以通过下调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达抑制肿瘤新生血管生成。Lai 等[10]研究表明，VEGF 低表达可抑制蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）激活，其是通过抑制VEGF/血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）/胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）/AKT 信号通路来实现的，一方面可以抑制乳腺癌新生血管生成和淋巴管再生，另外一方面可以通过触发活性氧介导的DNA损伤增强凋亡效应，从而增加放疗敏感性。因此推测FOXP3 可通过下调VEGF/AKT 信号通路实现对放疗敏感性的影响。本研究中FOXP3 阳性表达乳腺癌患者的局部失败率为2.9%，明显低于FOXP3 阴性表达患者的25.5%，差异有统计学意义（P﹤0.01），也说明了FOXP3 阳性表达乳腺癌患者较FOXP3阴性表达患者的放疗敏感性好。Lin等[11]对16 项临床试验共13 217 例乳腺癌患者进行Meta分析，结果显示，FOXP3 表达对乳腺癌患者预后的影响与其细胞内表达部位、阳性表达的判断标准、激素受体状态及地域差异相关，可能受不同遗传背景、手术方式及化疗方案等因素影响，其中ER阳性、亚洲地区、以中位数作为阳性表达的cut-off值这3 种情况下，FOXP3 表达与DFS 及总生存期获益显著相关。本研究中，FOXP3 阳性表达患者的1、3、5 年无病生存率分别为100%、100%、95.7%，FOXP3 阴性表达患者的1、3、5 年无病生存率分别为94.5%、81.4%、38.6%，FOXP3 阳性表达患者的DFS 明显优于FOXP3 阴性表达患者，差异有统计学意义（P﹤0.01）；单因素及多因素分析显示，FOXP3 阳性表达是乳腺癌放疗患者DFS 的独立保护因素（P﹤0.05）。提示干预FOXP3 蛋白表达或相关信号通路，有可能改善乳腺癌放疗患者的预后，FOXP3 可作为乳腺癌的治疗靶点。

综上所述，乳腺癌组织中FOXP3阳性表达率较低，FOXP3阳性表达乳腺癌患者放疗局部失败率低于FOXP3 阴性表达患者，且预后优于FOXP3 阴性表达患者，提高FOXP3表达水平能够改善乳腺癌患者放疗疗效及预后。后续可通过基因敲除等技术进一步验证FOXP3与放疗疗效的关系，也可以选择具有放疗抵抗的乳腺癌患者开展前瞻性随机对照、多臂多中心研究，观察针对FOXP3靶点的放疗增敏剂是否具有临床疗效。相信随着FOXP3 的全面深入研究，FOXP3不仅会成为乳腺癌放疗敏感性的分子标志物及治疗靶点，还有望为乳腺癌的诊断、个体化治疗及预后评估提供新思路。