中药延缓非小细胞肺癌表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂耐药机制的研究进展△

穆泓宇，何丹丹，王雅梅

首都医科大学1中医药学院2019级五年制中医专业，2基础医学院生化与分子生物学系，北京 100069

表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）敏感突变的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的一线用药，可以通过竞争性结合EGFR 的ATP 位点来阻断EGFR 末端磷酸化，阻止肿瘤细胞恶性增殖[1]。但绝大多数患者在治疗6～12 个月后会不可避免地出现获得性耐药，使得疾病再次进展[2]。中药既可以延缓EGFR-TKI 耐药的发生，又可以在耐药后增强EGFR-TKI 的抗肿瘤效果，起到协同增效的作用，是NSCLC 综合治疗的重要手段。近年来，相关综述大多集中在临床疗效的观察与中医理论的探讨，少有针对中药作用机制的系统总结。基于此，本文对中药延缓NSCLC EGFR-TKI 耐药机制的研究进展进行综述，以期为NSCLC 的中西医结合治疗提供作用机制方面的参考。

1 抑制EGFR 下游通路异常激活

EGFR 下游信号通路的持续活化是EGFR-TKI耐药的原因之一。当EGFR 被酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）抑制后，其他受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）可形成异源二聚体，代偿性地激活下游信号通路，使得作用于单一靶点的EGFR-TKI 失效。中药可以作用于EGFR 的下游通路，抑制其异常激活，进而延缓耐药。目前研究较为清楚的主要途径有以下3 条。

1.1 抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）通路

PI3K 是细胞外信号与细胞内应答的中转站，可以刺激细胞产生3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3, 4, 5-trisphosphate，PIP3），并诱导下游AKT活化，从而启动凋亡、自噬相关蛋白，调节细胞的增殖与分化。研究发现，抑制PI3K/AKT 及其下游通路的激活，可抑制肿瘤细胞耐药。

研究发现，中药可以有效抑制PI3K/AKT 通路，并延缓EGFR-TKI 耐药的出现。中药单体葫芦素E 和杨梅黄酮的组合物可以抑制NSCLC PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路介导的细胞自噬与活化[3]。重楼的单体成分重楼皂苷Ⅵ可以抑制PI3K/AKT 和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）对MTOR 的正向调节，同时激活AMP 依赖的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）对MTOR 的负向调节，通过多种途径诱导NSCLC 细胞凋亡和自噬[4]。上海中医药大学附属龙华医院徐振晔教授研制的肺岩宁方[5]、浙江省中医院舒琦瑾教授研制的养阴解毒汤[6]以及临床常用中成药复方苦参注射液[7]均可显著下调H1975 耐药细胞中p-PI3K、p-AKT 的水平，通过阻止PI3K/AKT 活化促进细胞凋亡，抑制耐药细胞体外增殖。藤黄的活性成分藤黄酸在与埃克替尼联合应用时也被观察到了同样的磷酸化抑制效应[8]。

此外，另有研究发现第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和程序性死亡受体4（programmed cell death 4，PDCD4）作为负向调节PI3K/AKT通路的主要蛋白，与EGFR-TKI 耐药性的产生密切相关[9]。金复康口服液与吉非替尼联合应用可以有效提高接种过PC9/R 耐药细胞的裸鼠移植瘤的生长抑制率，推测其机制可能与下调肿瘤组织中p-AKT 水平，上调PTEN、PDCD4等抑癌基因的表达有关[10]。进一步检测其上游微小RNA（microRNA，miRNA）发现，金复康口服液增强PTEN 的效应极有可能是通过降低miRNA-21 的表达而实现的[11]。上述实验结果表明EGFR 下游的PI3K/AKT 信号通路是中药发挥延缓耐药效应的重要靶点，中药可以抑制其过度激活，日后应更加深入地探索该通路被抑制的具体机制。

1.2 抑制促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路

MAPK 是丝-苏氨酸蛋白激酶家族的一员，主要有4 个亚群，分别是ERK、c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 激酶和ERK5。研究发现，MAPK 通路的异常激活是EGFR-TKI 获得性耐药产生的重要原因[12]。

姜黄提取物β-榄香烯具有较好的抗耐药效应，联合厄洛替尼可以显著抑制H1975 耐药细胞生长，推测机制可能与下调p-ERK、p-EGFR、p-MTOR 表达，促进耐药细胞凋亡有关[13]。参芪扶正注射液可以通过降低p-EGFR、p-MEK 和p-ERK 水平，抑制MAPK/甾醇调节元件结合转录因子1（sterol regulatory element binding transcription factor 1，SREBP1）通路的激活，促进PC-9/GR 细胞凋亡，从而增强NSCLC 对吉非替尼的敏感性[14]。金花茶提取物可以通过抑制MAPK 和PI3K/AKT 通路发挥抗NSCLC 的作用，提示其可能具有延缓EGFR-TKI耐药的潜力[15]。上述结果表明，中药可以显著下调MAPK 的表达，与EGFR-TKI 联合应用起到增效的作用，进而延缓耐药。其中，姜黄、金花茶等药食同源类中药的使用将为NSCLC 的防治提供更加安全而多样的选择。

1.3 抑制Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）通路

STAT3 是STAT 家族中的一员，可以通过调控B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）等凋亡相关蛋白的表达水平来促进肿瘤细胞的增殖、分化，其异常激活往往与获得性耐药关系密切[16]。

Zhou 等[17]发现，黄连解毒汤可以通过降低耐药肺癌细胞中p-STAT3 的水平发挥类似siSTAT3 的效应，进而激活胱天蛋白酶（caspase）3 等凋亡相关蛋白，抑制Bcl-2、Ki-67 等抗凋亡蛋白的表达，由此诱导细胞凋亡，增强NSCLC 对厄洛替尼的敏感性。沈存思等[18]将适宜浓度的高良姜素与吉非替尼联合应用于A549 细胞时亦观察到上述STAT3 磷酸化被抑制的现象，表明JAK-STAT3 可能是中药延缓一代、二代EGFR-TKI 耐药的共同靶点。Yu等[19]发现，葫芦素B 可通过上调miRNA-175p 抑制PC9/GR 细胞中STAT3 活化，降低吉非替尼耐药细胞的存活率。Wang 等[20]发现，扶正抗癌方可以通过抑制STAT3 表达，激活凋亡通路，增强吉非替尼的疗效。蔡雪婷等[21]发现，双氢青蒿素可在不影响TKI 活性的前提下，通过抑制STAT3 提高肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。综上所述，中药通过抑制JAK/STAT3 通路，可以进一步增强EGFR-TKI 的敏感性，有效缓解耐药。

2 抑制EGFR 旁路代偿性激活

除了下游通路外，旁路的代偿性激活也是EGFR-TKI 产生耐药性的重要原因。当EGFR 的信号被TKI 阻断时，其他RTK 通路可因反馈机制而代偿性激活或扩增。此时TKI虽然保持着对EGFR的抑制能力，但异常激活的旁路信号仍可促进下游癌基因的表达，使得EGFR-TKI 失去抑制肿瘤的药理效果。目前研究较为清楚的主要有以下3条途径。

2.1 抑制细胞间质上皮转换因子（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET）旁路

c-MET 是由原癌基因MET编码的具有酪氨酸激酶活性的自主磷酸化跨膜受体，参与细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等多种生理过程，其大量扩增是EGFR-TKI 获得性耐药的最常见机制。陈琦等[22]发现，β-榄香烯与吉非替尼联合应用可显著降低PC-9 耐药细胞的存活率，推测机制可能与p-MET 和p-AKT 蛋白表达受抑制有关。Kim 等[23]发现，中药峨参的活性成分去氧鬼臼毒素（deoxypodophyllotoxin，DPT）可以显著抑制MET 激酶活性，降低p-MET 及其下游蛋白磷酸化erb-b2 受体酪氨酸激酶3（erb-b2 receptor tyrosine kinase 3，ERBB3）的表达水平，从而诱导NSCLC 吉非替尼耐药株HCC827GR 细胞凋亡。Oh 等[24]发现，峨参的另一种活性成分鬼臼毒素（podophyllotoxin，PPT）也可以通过抑制c-MET 激酶活性诱导吉非替尼耐药细胞凋亡。Zheng 等[25]发现，扶正抗癌方通过下调c-MET的mRNA 水平和启动子活性，降低c-MET 蛋白的表达量，进而增强厄洛替尼对耐药NSCLC 细胞的生长抑制作用。以上文献说明中药可以通过抑制c-MET基因表达、降低c-MET 激酶活性来改善EGFR-TKI 耐药。

2.2 抑制AXL 受体酪氨酸激酶（AXL receptor tyrosine kinase，AXL）旁路

AXL 是受体酪氨酸激酶TAM 家族中的一员，介导与肿瘤相关的多种转录因子和信号通路的激活。研究表明，EGFR-TKI 耐药的NSCLC 中存在AXL 的异常激活[26]。Lee 等[27]发现，雷公藤红素可以通过抑制AXL的表达恢复耐药的NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性。Kim 等[28]发现，槲寄生提取物可以在顺铂耐药细胞和厄洛替尼耐药细胞中阻断生长抑制特异性蛋白6（growth arrest specific 6，GAS6）与配体AXL结合，同时通过抑制AXL表达来治疗耐药的NSCLC。这些研究以AXL通路为靶点，为克服NSCLC EGFR-TKI的耐药提供了天然候选药物。

2.3 抑制其他旁路

Wang 等[29]发现，丹参酮可以通过显著降低耐药细胞株内p-血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）和p-AKT 的表达来增加其对吉非替尼的敏感性，提示丹参酮逆转耐药可能与抑制VEGFR2/AKT 途径有关。蒋立峰等[30]发现，将清肺化瘀解毒方和吉非替尼联合应用于吉非替尼获得性耐药细胞株A549/R 后可以抑制其增殖并诱导凋亡，同时伴有胰岛素样生长因子1 受体（insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）蛋白及mRNA 表达的下调，表明清肺化瘀解毒方逆转耐药的机制与下调IGF1R 及其下游通路有关。

综上所述，中药复方或活性成分可通过直接靶向PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT3 等EGFR 下游通路，或抑制c-MET、AXL、VEGFR、IGF1R 等旁路，抑制耐药肿瘤细胞增殖，增强NSCLC 细胞对EGFR-TKI 的敏感性，从而延缓、改善获得性耐药，为NSCLC 的中医治疗提供了依据与方向。中药通过抑制EGFR 下游通路及旁路延缓耐药的具体机制详见图1。

图1 中药通过抑制EGFR下游通路及旁路延缓耐药的作用机制

3 抑制上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT 是上皮细胞通过去分化逐渐获得间质细胞表型的生物学过程，与EGFR-TKI 获得性耐药密切相关。Yuan 等[31]将葫芦素B 作用于转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导的吉非替尼耐药细胞，发现间质细胞标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白等表达降低，上皮细胞标志物E-钙黏蛋白等表达升高，说明葫芦素B 具有抑制耐药细胞EMT 的功效，机制可能与抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）和PI3K/AKT/MTOR 通路有关。Peng 等[32]通过体内外实验发现，芦荟大黄素可以阻断PI3K/AKT/扭曲家族bHLH 转录因子1（twist family bHLH transcription factor 1，TWIST1）通路，逆转EMT，增加耐药细胞对吉非替尼的敏感性。类似地，昆布提取物岩藻黄质可以抑制EMT并阻断PI3K/AKT/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路信号转导，阻止肿瘤细胞转移，与吉非替尼联合应用可以更显著地抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[33]。黄芪多糖可以通过降低程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）和SREBP1 的表达，抑制PD-L1/SREBP1/EMT 信号通路，进而抑制EMT 过程，改善肺腺癌细胞对吉非替尼的抵抗[34]。综上所述，中药可以通过抑制EMT，抑制肿瘤细胞表型转变，从而延缓EGFR-TKI 耐药。

4 表观遗传调控

表观遗传调控是当前NSCLC EGFR-TKI 耐药性研究的热点。它指的是在不改变EGFR基因序列的前提下，通过基因表达模式的演变，即DNA 甲基化、非编码RNA 调控、组蛋白乙酰化等过程，诱导NSCLC 产生耐药性。研究表明，表观遗传改变是NSCLC 靶向治疗获得性耐药的重要机制之一，针对表观遗传的药物可以在一定程度上延缓或逆转EGFR-TKI 相关的获得性耐药。

Liu 等[35]研究发现，β-榄香烯与吉非替尼联合应用可以通过降低甲基转移酶3，N6-腺苷-甲基转移酶复合体催化亚基（methyltransferase 3, N6-adenosine-methyltransferase complex catalytic subunit，METTL3）的表达来抑制N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化，从而抑制自噬相关蛋白5（autophagy related protein 5，ATG5）和自噬相关蛋白7（autophagy related protein 7，ATG7）的表达，阻止耐药肿瘤细胞自噬。此外，Cheng 等[36]发现，β-榄香烯还可以通过下调H3K27 的甲基转移酶zeste2多梳抑制复合体2 亚基增强子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）的表达来抑制NSCLC 的干细胞样特征，进而抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。除了通过抑制甲基化改善耐药，Dai等[37]发现，黄芪甲苷Ⅳ可以上调NSCLC细胞中一种NAD+依赖性Ⅲ类脱乙酰酶沉默调节蛋白6（sirtuin 6，SIRT6）的mRNA表达，进而诱导NSCLC对吉非替尼的增敏效应。Wu等[38]发现，治癌名方消积汤可能通过抑制HOX 转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）的表达，从而抑制核转录因子Sp1 转录因子（Sp1 transcription factor，SP1）的表达来增强吉非替尼对肺癌耐药细胞的生长抑制作用，从长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的角度揭示了中药改善耐药的全新分子机制。以上研究说明，中药可以通过调节DNA甲基化、组蛋白乙酰化、lncRNA表达等方式，调控表观遗传信息，发挥延缓耐药的效应。

5 小结与展望

综上所述，中药可以广泛作用于EGFR 通路上的不同环节，从多种途径缓解EGFR-TKI 获得性耐药，提高靶向药物的普遍疗效。然而，目前对于中药延缓EGFR-TKI 耐药的实验研究尚存不足：①在作用机制的研究上，现有实验对常见的耐药机制研究较为深入，但缺乏对罕见耐药靶点的关注。②在信号通路的研究上，部分实验仅观察到中药抑制某条信号通路的现象，却没有进一步探索中药抑制该信号通路的原因。这使得同一中药的不同作用机制间很难建立联系，不利于系统化研究。未来的研究应创新思路，在确保中医药临床疗效的前提下，以多靶点、多通路的模式更加全面、深入地探讨中药改善耐药的作用机制，为中医药与EGFR-TKI 的联合治疗方案开拓更加广阔的应用前景。