纳米氧化锌缓解大豆铝胁迫生理机制

刘灵锐 ，曾梓健，年 海，连腾祥

(华南农业大学 农学院, 广东 广州 510642)

酸性土壤(pH ≤ 5)占全球耕地面积的30%[1-2]。铝(Al)毒害是酸性土壤中作物生长的主要限制因子[3]，在酸性条件下，难溶性Al 会加速溶解，而含量在微摩尔水平的Al3+就可以抑制根系生长及其对水分和养分的吸收[4]。随着Al3+在植物体内的转移，在植物的生长过程中光合色素的合成会明显受阻，造成光合产物含量下降。同时，植物细胞内大量分布的Al3+会诱导产生大量的活性氧离子(Reactive oxygen species，ROS)，给植物带来氧化压力，造成植物细胞内脂质的过氧化，进而破坏植物细胞质膜等结构，给植物的生长带来更进一步的伤害，最终导致作物产量下降[5]。近年来，土壤酸化现象越来越严重，尤其是工业化活动产生酸雨和大量施用生理酸性肥料，导致土壤中碱性盐基离子减少，Al3+和H+增加，进一步对作物的生长造成负面影响[6]。

大豆Glycinemax(Linn.) Merr.是对Al 胁迫敏感的作物之一，特别是在我国质地黏重、肥力差、酸性强的砖红壤和赤红壤上种植的大豆，Al 毒害严重阻碍它们的生长[7-9]。不同的大豆品种对Al 耐受性有较大的差异，耐Al 品种在Al 胁迫下的反应更加迅速，有机酸(柠檬酸盐等) 的分泌量和抗氧化酶(SOD、CAT 和POD 等)活性相比于Al 敏感品种均显著上升[10-12]。目前已经在许多植物中鉴定出与耐Al 相关的基因，包括与有机酸分泌相关的ALMT基因家族和与有毒物质排出相关的MATE 基因家族等[13]。然而，培育耐Al 性强且适宜大面积推广的大豆品种需要较长的周期，因此，仍需要更高效的方法缓解Al 胁迫。

纳米技术作为一个新兴的领域，在提高农业投入有效性和作物产量、改善粮食安全等方面展示出良好的效果和广阔的前景[14]。纳米氧化锌(Zinc oxide nanoparticles，ZnO NPs)是目前应用较广泛的纳米粒子[15]，其特殊的纳米结构和纳米特性，吸引了众多科学家的关注，也逐渐在农业生产当中表现出积极效应，例如促进种子萌发、幼苗生长，缓解非生物胁迫和提高植物抗性等[16-18]。然而，ZnO NPs 带来的负面影响不可忽视，有研究表明，ZnO NPs 存在剂量效应：高剂量的ZnO NPs 不利于植物的生长，会抑制植物的发芽和叶绿素的生物合成，减少生物量的积累，在植物体内产生氧化应激信号等[19]。作为一种具有超微粒径的颗粒，ZnO NPs 可以从生理、生化以及分子层面对植物产生显著的影响，其作用大小主要取决于植物品种、生长阶段、生长环境以及ZnO NPs 的施用方法等[20]。

综上所述，一定浓度的ZnO NPs 可以促进植物生长发育和缓解植物非生物胁迫，然而目前关于ZnO NPs 能否缓解大豆Al 胁迫从而促进大豆生长发育的研究还鲜有报道。基于此，本研究利用耐Al 性不同的大豆品种，探索不同含量的ZnO NPs 对不同基因型大豆生长生理指标的影响，综合评价其在缓解大豆Al 胁迫中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验概况

试验于2021 年3 月在广东省广州市华南农业大学校内(23°9'N、113°21'E)开展，所用土壤采集自校内砂壤土，土壤基本农化性状为pH 4.58(水、土质量比为2.5∶1)，有机碳56.37 g/kg，铵态氮37.69 mg/kg，硝态氮91.9 mg/kg，有效磷87.11 mg/kg 和速效钾62.98 mg/kg。盆栽培养期间日平均温度为21 ℃。

1.2 试验材料

耐Al 品种‘华春2 号’和普通品种‘华春6 号’[21]由华南农业大学农学院国家大豆改良中心广东分中心提供；w(ZnO NPs)＞ 99.6%；使用十八水合硫酸铝[(Al2(SO4)3·18H2O)]模拟Al 胁迫。

1.3 试验方法

1.3.1 盆栽试验 普通盆栽试验用盆规格为高150 mm、顶部直径200 mm、底部直径150 mm，每盆装入供试土壤1 kg。Al 胁迫处理Al 含量为0.3 g/kg(Al3+/土壤，m/m)。ZnO NPs 含量分别为 0、25、50、100 和150 mg/kg(ZnO NPs/土壤，m/m)。大豆播种前，分少量多次，均匀拌入Al2(SO4)3·18H2O 和ZnO NPs。选择饱满一致、无虫蛀、发芽率高的‘华春2号’和‘华春6 号’种子播种，出苗6 d后定植，每盆4 株，生长期间保持土壤含水量(ω) 为70% 左右。每个处理设3 次重复。生长30 d 后，测定幼苗期大豆的株高、鲜质量、根长。取叶片测叶绿素含量、总超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase，T-SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)浓度。

1.3.2 大豆鲜质量与根长测定 采用直尺 (单位：mm)测量幼苗株高 (植株根颈部到顶部心叶之间的距离)和根长 (植株根颈部到主根根尖的距离)。将植株用去离子水洗净并吸干表面水分，使用电子天平测定鲜质量。

1.3.3 叶绿素含量测定 随机摘取新鲜的成熟叶片，取 0.5 g 叶片洗净剪碎放入研钵中，加入少许CaCO3、石英砂及 3 mL 无水丙酮，研成匀浆，再加入 10 mL 无水丙酮继续研磨充分，于黑暗条件下静置 2 h。随后用滤纸和漏斗将提取液转移至 50 mL容量瓶中，用无水丙酮冲洗研钵、研棒和残渣，最后定容至 50 mL 并且摇匀。取叶绿素提取液在紫外分光光度计上测定D663nm和D645nm，随后根据朗博-比尔定律计算叶片中的叶绿素 a 和叶绿素 b 含量[22]。

1.3.4 T-SOD 活性及MDA 浓度测定 使用购买自南京建成生物研究所的T-SOD 试剂盒(货号：A001-1) 和MDA 试剂盒(货号：A003-1) 测定TSOD 活性和MDA 浓度，测定方法分别为黄嘌呤氧化酶法[23]和硫代巴比妥酸法[24]。

SOD 活性：准确称量新鲜的大豆根系0.1 g，加入5 mL 磷酸盐缓冲溶液(pH = 7.4)在冰水浴下进行研磨，制成组织匀浆后，于3 500 r/min 离心10 min，上清液即为待测样品。准备2 支试管，分别为测定管和对照管。在测定管中依次加入试剂一应用液1 mL、样品0.05 mL、试剂二0.1 mL、试剂三0.1 mL 和试剂四应用液0.1 mL；在对照管内依次加入试剂一应用液1 mL、蒸馏水0.05 mL、试剂二0.1 mL、试剂三0.1 mL 和试剂四应用液0.1 mL。用旋涡混匀器充分混匀，置37 ℃恒温水浴40 min。加入显色剂后室温放置10 min，用紫外分光光度计测量D550nm，按下列公式进行换算。

MDA 浓度：准确称量新鲜的大豆根系0.1 g，加入5 mL 磷酸盐缓冲溶液(pH = 7.4)在冰水浴下进行研磨，制成组织匀浆后，于3 500 r/min 离心10 min，上清液即为待测样品。准备4 支试管，分别为空白管、标准管、测定管和对照管。在空白管内依次加入无水乙醇溶液0.2 mL、试剂一0.2 mL、试剂二应用液3 mL 和试剂三应用液1 mL；在标准管内依次加入10 nmol/mL 四乙氧基丙烷溶液0.2 mL、试剂一0.2 mL、试剂二应用液3 mL 和试剂三应用液1 mL；在测定管内依次加入样品0.2 mL、试剂一0.2 mL、试剂二应用液3 mL 和试剂三应用液1 mL；在对照管内依次加入样品0.2 mL、试剂一0.2 mL、试剂二应用液3 mL 和50%(φ)冰醋酸溶液1 mL。加入所有试剂后，用旋涡混匀器混匀，95 ℃水浴40 min 后用自来水冷却。以3 500 r/min 离心10 min，取上清液，用紫外分光光度计测量D532nm。按下列公式计算MDA 浓度。

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS 20.0 数据处理系统和Excel 2019 进行统计分析，试验结果经方差分析后进行Duncan’s 多重比较和t检验比较各处理间的差异。

2 结果与分析

2.1 ZnO NPs 对Al 胁迫条件下大豆植株鲜质量和根长的影响

在未添加ZnO NPs 情况下，对不同品种施加0.3 g/kg 的Al 处理，Al 显著抑制了‘华春6 号’的鲜质量和根长，而对‘华春2 号’的鲜质量和根长无显著影响(图1)。对Al 胁迫下的2 个品种施加不同含量的ZnO NPs，当ZnO NPs 为150 mg/kg时，‘华春6 号’和‘华春2 号’的鲜质量达到最大值，同没有ZnO NPs 处理相比，分别提高了100.6%和42.7%((图1A、1B))。根长方面，150 mg/kg ZnO NPs 处理后，‘华春6 号’的根长达到最大值(27.0 cm)，‘华春2 号’的根长也达到27.2 cm；当ZnO NPs 含量为50 和100 mg/kg 时，‘华春2 号’的根长显著低于无ZnO NPs 处理的(图1C、1D)。由此说明在Al 胁迫下，150 mg/kg 的ZnO NPs 有助于提高大豆植株的鲜质量和根长，从而改善大豆的生长。

2.2 ZnO NPs 对Al 胁迫条件下大豆植株叶绿素含量的影响

由图2 所示，随着ZnO NPs 含量的增加，Al 胁迫的存在对2 个品种叶绿素a 和叶绿素b 含量的影响不同。在未添加ZnO NPs 情况下，Al 胁迫对‘华春6 号’的叶绿素a 和叶绿素b 含量无明显影响，而显著增加了‘华春2 号’的叶绿素a 和叶绿素b 含量，分别达到12.8 和7.7 mg/g。Al 胁迫下，当ZnO NPs 含量为25 mg/kg 时，‘华春6 号’和‘华春2 号’的叶绿素a 含量达到最高水平，相比于未添加ZnO NPs 处理分别上升了20.3%和2.9%(图2A、2B)。不同含量的ZnO NPs 处理对‘华春6 号’的叶绿素b 含量变化影响不明显；‘华春2 号’中，ZnO NPs 处理显著降低了叶绿素b 含量，在ZnO NPs 含量为100 mg/kg 时达到最低(3.5 mg/g)(图2C、2D)。

图2 ZnO NPs 对Al 胁迫条件下大豆植株叶绿素a 和叶绿素b 含量的影响Fig. 2 Effect of ZnO NPs on chlorophyll a and chlorophyll b contents of soybean plantlets under Al stress

2.3 ZnO NPs 对Al 胁迫条件下大豆T-SOD 活性和MDA 浓度的影响

T-SOD 是植物体内重要的抗氧化酶，其活性的高低直接反映植物细胞的抗氧化能力。当不添加ZnO NPs 时，Al 胁迫对‘华春6 号’和‘华春2 号’的T-SOD 活性均无显著影响(图3A、3B)。当添加不同含量的ZnO NPs 后，‘华春6 号’的T-SOD 活性随着ZnO NPs 含量增加而升高，150 mg/kg处理时达到最大值，而‘华春2 号’中T-SOD 活性最大值出现在50 mg/kg 处理中。无论哪个品种，在Al 胁迫条件下添加ZnO NPs 处理后，T-SOD 的活性均高于未添加ZnO NPs 处理，说明ZnO NPs 处理有利于提高大豆根系中T-SOD 的活性，增强大豆的抗氧化能力，从而应对外界造成的氧化伤害。

图3 ZnO NPs 对Al 胁迫下大豆T-SOD 活性及MDA 浓度的影响Fig. 3 Effect of ZnO NPs on T-SOD activity and MDA concentration of soybean plantlets under Al stress

当ZnO NPs 含量为0 时，Al 胁迫显著增加了‘华春6 号’的MDA 浓度，而对‘华春2 号’的MDA 浓度无显著影响(图3C、3D)。当添加不同含量的ZnO NPs 后，‘华春6 号’的MDA 浓度随ZnO NPs 含量增加而上升，可能是由于ZnO NPs 与Al3+协同作用对大豆植株造成了损害。而‘华春2 号’呈相反趋势，随着ZnO NPs 含量上升，‘华春2 号’中MDA 浓度呈下降-升高-下降的变化，并在ZnO NPs 含量为50 mg/kg 时达到最低水平，与无ZnO NPs 处理相比下降了20.9%，此时能有效抵抗Al3+对‘华春2 号’的损伤。综上，Al 胁迫使2 种大豆的MDA 水平升高，当施用的ZnO NPs 含量小于100 mg/kg 时，能有效控制2 种大豆的MDA 浓度，从而降低植物细胞内脂质过氧化水平，达到保护植物细胞的目的。

3 讨论与结论

低浓度的ZnO NPs 对植物的生长具有促进作用[25]。在其对植物的生长具有毒性的报道中，试验处理的纳米颗粒的质量浓度大多都达到了较高的水平(≥ 1 000 mg/L)[26-27]。金属纳米材料在使用过程中，离子会部分释放并被植物吸收，发挥营养元素的功能，当浓度过量时会不可避免地激活植物自身的防御机制，如增加木质素和胼胝质的生物合成，进而限制植物的生长[28-29]。本研究表明Al 胁迫显著抑制耐Al 性较弱的‘华春6 号’的鲜质量和根长，这与前人观察到的结果[30]一致。而ZnO NPs 对Al 胁迫下‘华春6 号’的根长具有显著促进作用，说明低含量的金属纳米颗粒具有改善处于Al 胁迫条件下的大豆的生长发育的潜力。此外，Al 胁迫增加了耐Al 品种‘华春2 号’的叶绿素含量，而敏感品种‘华春6 号’的叶绿素含量受到Al 胁迫的明显抑制。这与前人的研究结果存在一定差异，前期研究普遍认为随着Al3+在植物体内的积累，在植物生长后期，Al 胁迫会抑制光合色素的生物合成，影响植物光合作用，最终导致叶片黄化和产量下降[31]。本研究主要集中在大豆苗期，Al 胁迫对光合色素的影响较小或许和处理周期较短有关。ZnO NPs 促进了‘华春2 号’叶绿素a 的生物合成，这进一步说明了低剂量条件下ZnO NPs 可促进植物生长。也有研究尝试将ZnO NPs 和有机改良剂一起作为叶面喷肥在小麦中使用，发现ZnO NPs 可以和有机改良剂协同作用，促进小麦生长，如提高生物量和叶绿素含量等[32]。

Al3+诱导植物细胞产生的过量ROS 会破坏正常的细胞结构。这一过程中植物SOD 的活性会增强，消除过量的ROS，保护植物细胞。不同作物对Al 胁迫的反应程度有所不同，受到的伤害也有区别[33]。本研究中，Al 胁迫增加了大豆根系中MDA 浓度，表明Al 胁迫加剧了大豆根系中脂质的过氧化，但是Al 处理后大豆根系中的T-SOD 活性没有显著升高。当ZnO NPs 加入土壤后，大豆根系中的T-SOD活性显著增强，MDA 浓度基本随之下降。前期研究在镉污染的水稻中发现，ZnO NPs 可以通过提高SOD 活性以及降低MDA 浓度从而保护水稻正常生长[34]。这说明ZnO NPs 可以通过激活植物体内的SOD，提高植物抗氧化能力，降低植物细胞内脂质的过氧化水平，从而保护植物细胞，促进植物生长[34]。

综上，Al 胁迫严重影响大豆的生长发育，施用ZnO NPs 可在一定程度上缓解Al 胁迫对植株产生的负面作用。低剂量的ZnO NPs(50 mg/kg)可以显著增加大豆SOD 活性，降低MDA 浓度，降低细胞脂质过氧化程度，提高植物抗氧化能力，增强大豆对含Al 土壤的耐受性；而较高剂量的ZnO NPs 或将对大豆的生长造成不利的影响。因此，合理施用ZnO NPs 是缓解植物Al 胁迫、改善植物生长的关键。