β-卡波林生物碱Benzalharman和Kumujian C对 炎性信号通路NF-κB及MAPK的调控作用机制

王 革,宗明月,高银鹤,徐瑶瑶,王 锴,赵 烽

(烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,山东 烟台 264005)

炎症是机体应对刺激的一种防御反应,但是过度持续的炎症反应可能对人体造成生理和病理损害,从而导致一系列的疾病,如类风湿性关节炎、哮喘、冠心病、休克等[1]。苦木Picrasmaquassioides(D. don)Bennet是苦木科苦木属植物,在中国民间传统用药中广泛应用于抗炎治疗,已有报道证明苦木的主要活性化学成分为生物碱,包括β-卡波林生物碱、铁屎米酮生物碱和二聚生物碱[2]。Benzalharman和Kumujian C是两个β-卡波林生物碱,但是这两个化合物的抗炎活性及其机制未被报道过。为了研究这两个化合物的体外抗炎活性及抗炎机制,本研究首先利用分子对接技术分析了这两个化合物和炎症靶点蛋白(iNOS和COX-2)之间的相互作用以及氨基酸残基的活性位点[3],然后以脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞RAW 264.7建立体外炎症反应模型,考察它们的体外抗炎活性以及对NF-κB和MAPK细胞信号通路的调节作用,从而阐明Benzalharman和Kumujian C的抗炎分子机制。

图1 β-卡波林生物碱Benzalharman和Kumujian C的结构式

1 材料和方法

1.1 化合物和试剂

Benzalharman和Kumujian C纯度经过鉴定为HPLC> 98%,均溶解为50 mmol·L-1的溶液;小鼠巨噬细胞RAW 264. 7(ATCC TIB-71)(中科院上海细胞库);RPMI 1640培养基(Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(NQBB国际生物公司);MTT、LPS、DMSO (Sigma-Aldrich);氢化可的松琥珀酸钠注射液(天津生化药业);NO测定试剂盒(烟台赛尔斯生物技术有限公司);小鼠TNF-α ELISA 试剂盒(R&D公司);小鼠IL-6 ELISA试剂盒以及PGE2ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司);iNOS、COX-2 antibody (Santa Cruz Biotechnology);goat anti-rabbit p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 poly-clonal antibody(Affinity公司);goat anti-rabbit IκB-α polyclonal antibody和β-actin抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc)。

1.2 分子对接

在对接之前,对两个待测化合物以及靶标蛋白进行优化。化合物分子结构优化采用Minimize功能模块,优化过程中采用Powell能量梯度法和Tripos力场,Gasteiger-Huckel方法来添加电荷,最大迭代次数为1000,能量收敛条件为0.021 kJ/mol,其他参数采用软件默认值。蛋白质由PDB数据库中获得,在蛋白质修饰过程中,使用SYBYL X2.0的默认蛋白准备流程,先提取原始配体,然后将配体中的蛋白质进行氢化处理,并加载Gasteiger-Huckel电荷,删除蛋白质复合物上的所有水分子。最后使用Surflex-dock的超高精度模式进行分子对接。

1.3 RAW 264.7细胞培养、分组以及药物处理

将密度为1×106个/mL的RAW 264.7细胞接种到96孔板中,放入37 ℃下,5% CO2的培养箱培养,使其贴壁1 h。将细胞分为4个组,包括空白组、模型对照组、阳性药对照组、给药组,每个给药浓度设3个平行复孔。模型对照组、阳性药对照组、给药组用2 μL的1 μg·mL-1LPS处理。空白组加入0.4 μL DMSO,模型对照组加入0.4 μL DMSO,阳性药对照组加入0.4 μL氢化可的松琥珀酸钠注射液(HSS,终浓度为50 μmol·L-1),给药组加入0.4 μL Benzalharman和Kumujian C(12.5、25、50 μmol·L-1)。

1.4 MTT法评价药物的细胞毒性

按“1.3”的细胞培养及处理方法,但只将细胞分为两组,即空白组和给药组。孵育24 h后取出96孔板,向每孔中加入8 μL的200 μg·mL-1的MTT溶液。继续培养4 h,弃去上清液,培养板中的蓝紫色甲臜结晶用150 μL DMSO充分溶解,随后将96孔板放入酶标仪中,设定双波长570 nm和630 nm,测吸光度。

1.5 Griess法测定NO浓度

按“1.3”的细胞处理方法,培养箱中培养24 h,吸取100 μL的上清液于新的96孔板中,加入100 μL 之前配制好的Griess试剂,在室温下孵育10 min后,用酶标仪在540 nm处测定混合溶液的吸光度,用不同浓度亚硝酸钠溶液制备的标准曲线计算亚硝酸盐的浓度。

1.6 ELISA法测定PGE2、TNF-α和IL-6浓度

按“1.3”的细胞处理方法,培养结束后,每孔吸取100 μL上清液,分别使用小鼠PGE2、TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒检测PGE2、TNF-α和IL-6水平。

1.7 Western blot法检测 iNOS、COX-2、IκB-α、p-JNK、p-ERK和p-p38蛋白水平

1.7.1 蛋白提取及定量 将RAW 264.7细胞在96孔板中培养,吸取3 mL细胞液接种至60 mm培养皿中,并使其贴壁1 h。将其分为三组,包括空白组、模型对照组、给药组。空白组加入6 μL DMSO,模型对照组加入30 μL LPS和6 μL DMSO,给药组加入30 μL LPS和6 μL不同浓度(12.5、25、50 μmol·L-1)的Benzalharman和Kumujian C。24 h后提取总蛋白用于检测iNOS和COX-2的水平。加入LPS刺激提取总蛋白水平的时间分别为,IκB-α 10 min、p-JNK 15 min、p-ERK和p-p38 1 h。按BCA定量试剂盒说明书进行定量。

1.7.2 蛋白质印迹分析 根据SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制相应的分离胶与浓缩胶。将蛋白样品以及Marker加入到上样孔中,电泳,转PVDF膜,在室温下膜与7%的脱脂奶粉封闭4 h。加入一抗4 ℃孵育过夜。再加入二抗37 ℃孵育1 h。洗膜3次,加入ECL发光显色液,放入显影仪中收集图像并使用软件Image J分析条带的灰度值。

1.8 统计分析

2 实验结果

2.1 Benzalharman和Kumujian C与靶标蛋白(iNOS或COX-2)的分子对接结果

使用SYBYL-X2.0 Docking Suite模块对化合物Benzalharman和Kumujian C与iNOS或COX-2之间进行分子对接研究。如图2所示,与iNOS蛋白(PDB代码:3E7M)对接时,Benzalharman分别与受体蛋白中的ARG-375和TRP-457形成两个氢键,Kumujian C与受体蛋白中的ARG-375形成两个氢键。但是,与COX-2蛋白(PDB代码:5IKR)对接时,Benzalharman和Kumujian C和受体蛋白均无氢键形成。

图2 β-卡波林生物碱Benzalharman(1)和Kumujian C(2)与靶点蛋白iNOS和COX-2对接结果

2.2 Benzalharman和Kumujian C对RAW 264.7细胞增殖的影响

如图3所示,Benzalharman和Kumujian C在12.5、25、50 μmol·L-1时,作用24 h对RAW 264.7细胞的增殖无影响,细胞存活率均大于90%。表明两个化合物在50 μmol·L-1以下浓度无细胞毒性。

图3 β-卡波林生物碱Benzalharman(1)和Kumujian C (2)对RAW 264.7细胞增殖的影响

2.3 Benzalharman和Kumujian C对LPS诱导的NO、PGE2、TNF-α和IL-6释放的影响

如图4(a)所示,空白组RAW 264.7细胞在未受到LPS 刺激时,细胞只产生了少量的NO2-,在受到LPS刺激24 h后,NO2-的浓度显著升高(##P<0.01)。与LPS组相比,不同浓度(12.5、25、50 μmol·L-1)的Benzalharman和Kumujian C可以下调NO2-的浓度且具有良好的剂量依赖性(**P<0.01),表明两个化合物对LPS刺激的RAW 264.7细胞释放的NO有一定的抑制作用。如图4(b)所示,在12.5、25、50 μmol·L-1浓度下,Benzalharman和Kumujian C对LPS刺激产生的过量PGE2无抑制作用,与LPS组相比PGE2的浓度差异无统计学意义。如图4(c)所示,Benzalharman和Kumujian C对RAW 264.7细胞释放TNF-α均有一定的抑制作用(**P<0.01)。如图4(d)所示,Benzalharman和Kumujian C在12.5 ～50 μmol·L-1范围内均可显著抑制LPS诱导的IL-6的过量产生(**P<0.01)。

图4 β-卡波林生物碱Benzalharman(1)和Kumujian C(2)对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO、PGE2、TNF-α和IL-6的抑制作用

2.4 Benzalharman和Kumujian C对iNOS或COX-2蛋白表达的影响

如图5所示,空白组RAW 264.7细胞在未经LPS刺激时,只产生了极少量的iNOS和COX-2蛋白,在经过LPS刺激24 h后,iNOS和COX-2蛋白的表达大量增加(##P<0.01)。不同浓度Benzalharman和Kumujian C与LPS相比,可以显著降低iNOS蛋白的高表达(**P<0.01),而对COX-2蛋白的高表达无抑制作用,这与分子对接结果一致。

图5 β-卡波林生物碱Benzalharman(1)和Kumujian C(2)对LPS诱导RAW 264.7细胞iNOS和COX-2蛋白高表达的影响

2.5 Benzalharman和Kumujian C对IκB-α蛋白表达的影响

如图6所示,当RAW 264.7细胞被LPS刺激后IκB-α蛋白水平急速下降(##P<0.01)。Benzalharman(a)在一定程度上能抑制NF-κB 通路中IκB-α蛋白的降解,其中,当浓度为50 μmol·L-1时,Benzalharman更能显著抑制IκB-α蛋白降解(**P<0.01)。但是Kumujian C不能抑制IκB-α蛋白的降解。

图6 β-卡波林生物碱Benzalharman(1)和Kumujian C(2)对LPS诱导RAW 264.7细胞IκB-α蛋白降解的影响

2.6 Benzalharman和Kumujian C对MAPKs 信号通路激活的影响

如图7所示,空白组细胞未经刺激,只有少量的JNK、ERK以及p38蛋白发生磷酸化,当RAW 264.7细胞经LPS刺激后JNK、ERK以及p38蛋白发生磷酸化产生大量p-JNK、p-ERK以及p-p38蛋白,磷酸化水平明显升高(##P<0.01)。与LPS相比,Benzalharman和Kumujian C均不能抑制MAPKs通路中JNK、ERK和p38蛋白磷酸化。

图7 β-卡波林生物碱Benzalharman(1)和Kumujian C(2)对LPS诱导的RAW 264.7细胞中MAPKs通路JNK、ERK和p38蛋白磷酸化的影响

3 讨 论

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组成部分,具有很强的致热致炎性[4]。LPS可被巨噬细胞RAW 264.7表面的TLR4识别并结合,启动细胞内NF-κB和MAPKs 等炎性信号通路,从而导致多种炎症介质和炎症因子的释放以及下游通路炎症蛋白iNOS和COX-2的大量表达,引起机体损伤[5-7]。在iNOS的催化下,细胞中产生大量的炎症介质一氧化氮(NO),NO的含量与炎症的程度呈正相关[8]。本研究结果表明Benzalharman和Kumujian C抑制了NO的产生以及iNOS蛋白的高表达。环氧合酶(COX)是花生四烯酸代谢途径的关键酶,主要包括COX-1和COX-2两种亚型[9],除了NO,炎症发生时,COX-2可催化花生四烯酸生成炎症介质前列腺素E2(PGE2),导致PGE2过量表达[10],但Benzalharman和Kumujian C不能抑制PGE2的释放以及对COX-2蛋白表达无抑制作用。对于两个化合物对COX-2蛋白表达的在体实验以及对COX-1和COX-2的选择性,需要进一步实验进行研究。炎症反应中炎症因子的释放也会增多,例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)[11],本结果表明Benzalharman和Kumujian C均可抑制TNF-α、IL-6的释放。

炎症的发生和表达受NF-κB的调控,通常情况下,NF-κB被IκB-α抑制剂隔离在细胞质中,而炎症信号诱导IκB-α的磷酸化和进一步降解[12-13]。因此,IκB-α蛋白的降解程度可以作为NF-κB活化的重要指标。研究表明Benzalharman抑制了NF-κB信号通路中IκB-α蛋白的降解,Kumujian C不能抑制IκB-α的降解。

MAPK信号通路对细胞分化,应激反应和凋亡具有一定的调控作用,迄今为止,已在哺乳动细胞中报道了三种MAPK激酶:细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38亚型(p38)[14]。MAPK通路的激活总是从ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化开始。结果表明Benzalharman和Kumujian C对MAPK通路中的JNK、ERK和p38蛋白磷酸化均无抑制作用。

综上,Benzalharman阻断了NF-κB信号通路的激活并且选择性抑制下游炎症蛋白iNOS的表达以及NO、TNF-α、IL-6的释放发挥抗炎作用。Kumujian C选择性抑制下游炎症蛋白iNOS的表达以及NO、TNF-α、IL-6的释放,但对NF-κB和MAPKs 信号通路均无明显影响。本研究通过体外实验观察了两个生物碱的抗炎特性,如要进一步确证两个生物碱的抗炎作用及抗炎机制,还需要进行体内实验等更深入的研究。