基于16S rRNA基因测序探讨加味交泰丸对腹泻型肠易激综合征患者肠道菌群的影响

许琰杰,沈 文,臧海洋,徐 逸,刘丽娜,杨 芳

(南京中医药大学南通附属医院脾胃病科,江苏 南通 226000)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是由于中枢神经功能以及自主神经功能紊乱而引起肠道的运动和分泌功能失调的一种疾病,以慢性、反复发作的腹部不适和疼痛为特征[1],病情反复迁延不愈,还可出现睡眠障碍、精神抑郁或烦躁性慢性疲劳综合征等胃肠道外症状。近年来,IBS全球发病率逐年上升,严重影响患者的生活质量。腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant IBS, IBS-D)作为IBS的常见类型[2],其发病率高且好发于中青年。因此,有必要寻找高效安全的治疗方法。IBS的具体原因还未明确,目前已有文献报道该病与肠道菌群具有相关性,肠道微生态失衡在IBS发病机制中起到关键作用[3]。内脏高敏感被认为是IBS-D的重要体现[4],也可能是脑—肠轴功能异常的表现[5]。因而,IBS-D易出现抑郁、烦躁等情绪障碍,即中医理论的“心肾不交”。

交泰丸源自明代《韩氏医通》,由黄连、肉桂组成,是治疗“心肾不交”的经典方剂。交泰丸及其加味方主要用于失眠、心律失常及遗精等自主神经功能失调疾病,对IBS亦有较好的治疗效果。研究[6]显示,加味交泰丸能够改善IBS-D患者的临床症状,降低血清白细胞介素(interleukin, IL)-6,IL-8、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平且安全性较高。但对加味交泰丸治疗IBS-D的机制研究尚少,尤其对肠道菌群的影响尚未有报道。因此,本研究拟基于16S rRNA基因高通量测序技术,探究加味交泰丸对IBS-D患者肠道菌群的影响。

1 临床资料

1.1 诊断标准

1.1.1 IBS诊断标准 参照罗马Ⅳ诊断标准[7]。在过去的3个月中,平均每周至少1 d反复出现腹痛,诊断前症状出现至少6个月,近3个月符合以下两项或多项标准:①与排便有关;②与大便频率的变化有关;③与粪便形式(外观)的变化有关。

1.1.2 情绪障碍诊断标准 焦虑的评估采用焦虑自测量表(self-rating anxiety scale, SAS),SAS含有20个反映焦虑主观感受的项目,每个项目按症状出现的频度分为4级评分,其中15个为正向评分,5个为反向评分。50～59分为轻度焦虑,60～69分为中度焦虑,69分以上为重度焦虑。抑郁的评估采用抑郁自测量表(self-rating depression scale,SDS),SDS含有20个反映抑郁主观感受的项目,每个项目按症状出现的频度分为4级评分,其中10个为正向评分,10个为反向评分。63～72分为中度抑郁,72分以上为重度抑郁。

1.1.3 中医诊断标准 IBS-D的中医诊断标准参照《中医内科学》[8]以及《肠易激综合征中医诊疗专家共识意见(2017)》[9]中IBS-D的辨证分型,证型为心肾失交兼肝郁脾虚证,由两位副主任医师对证候进行辨证,以保证其统一性和权威性。

1.2 纳入标准 ①年龄为18～65周岁;②符合IBS-D的西医诊断标准,且中医辨证属于心肾失交兼肝郁脾虚证;③未合并严重心脑血管系统、呼吸系统、内分泌系统、泌尿系统、生殖系统、神经精神系统等疾病或肿瘤;④患者知情同意并签署知情同意书。

1.3 排除标准 ①已知对试验所用药物过敏或有不良反应的患者;②有精神疾病史,不能完全配合完成该临床试验的患者;③有高血压病、糖尿病、甲状腺功能亢进或甲状腺功能减退、消化道器质性病变的患者;④近3个月内服用过影响胃肠功能的药物。

1.4 一般资料 选取2020年10月至2021年10月南通市中医院门诊部招募的IBS-D合并情绪障碍(抑郁或焦虑)患者60例作为研究对象,经中医辨证均为心肾失交兼肝郁脾虚证。按照随机数字表法将其随机分为中药组与西药组,每组30例。西药组男16例,女14例,年龄18～65岁,平均年龄(42.77±12.44)岁;中药组男13例,女17例,年龄18～65岁,平均年龄(38.70±12.74)岁。两组患者的一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。另外选择在南通市中医院接受体检的健康者共10例作为健康对照组,男5例,女5例,年龄18～65岁,平均年龄(40.40±2.70)岁。本研究经南通市中医院伦理委员会批准,伦理批号: 通中院〔2020〕字006。

2 方法

2.1 干预方法 中药组采用加味交泰丸治疗。药物组成:炒白芍、炒山药各20 g,茯苓15 g,白术、陈皮、防风、五味子各10 g,炒柴胡、木香各6 g,肉豆蔻、炮姜、炙甘草各5 g,黄连、肉桂各3 g。中药剂型选用颗粒剂,由南通市中医院中药房提供,每日1剂,早晚分服150 mL,共治疗4周。

西药组患者服用地衣芽孢杆菌活菌胶囊(规格:每粒0.25 g;东北制药集团沈阳第一制药有限公司生产,国药准字号S10950019),每日3次,每次2粒,共治疗4周。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 16S rRNA基因测序技术检测肠道菌群 依照标准粪便采样流程,严格遵循无菌化操作原则,收集3组受检者粪便样本于无菌管中。使用PowerSoil DNA分离试剂盒按照说明书对粪便样本进行DNA提取。采用0.8%的琼脂糖凝胶检查基因组DNA的纯度和质量。采用引物338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)扩增细菌16S rRNA基因V3-V4高变区。对每个样品,正向引物和反向引物的5′端分别添加10位条形码序列。PCR使用5 μL DNA(总模板量为30 ng)在Mastercycler Gradient上进行。扩增条件为95 °C变性、55 °C退火、72 °C延伸各45 s。测序平台系统为Illumina 2.6系统。序列分析利用微生物生态学定量研究技术对原始序列进行修饰,通过归类操作,将序列按照彼此的相似性分归一个操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)。可根据相似度水平,对所有序列进行OTUs划分,通常对97%相似水平下的OTUs进行生物信息学的统计分析。根据OTUs聚类结果,使用Mothur进行分析,使用R语言工具制作稀疏曲线。

2.2.2 临床疗效 分别于治疗前及治疗4周后采用IBS严重程度评分系统(irritable bowel syndrome-severity scoring system, IBS-SSS)评估两组患者临床疗效,该评分系统从腹痛程度、腹痛频率、腹胀情况、排便满意度及生活困扰度5个方面进行评分,评分越高表明患者症状越严重。

2.3 统计学方法 利用QIIME v.1.8.0进行微生物α多样性分析,为了估计β多样性,采用R包进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA),组间差异使用Anosim分析。不同分类学水平的菌群差异使用Wilcoxon检验。采用LEfSe(LDA Effect Size)分析进行多个分组之间的比较:采用单因素方差分析检测不同分组间丰度差异显著(P<0.05)的物种,再用线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)对数据进行评估,选取LDA评分>3的物种。

3 结果

3.1 两组患者治疗前后IBS-SSS评分比较 两组患者治疗前IBS-SSS评分比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗4周后,两组患者IBS-SSS评分均较治疗前显著下降(P<0.05),且中药组评分降低程度更显著(P<0.05)。见表1。

3.2 测序数据 在97%相似度条件下,对序列进行操作单元聚类,获得OTUs代表序列1 022个。稀释曲线结果显示,当测序的序列数达到20 000条时,曲线趋于平缓,提示数据量饱和,测序深度足以覆盖物种中的OTUs。见图1。OTUs数据的韦恩图显示,5组样本的“核心OTUs”为224种,Normal组特有OTUs为137种,Pre_BL组特有OTUs 76种,Pro_BL组特有OTUs 11种, Pre_JWJT组特有OTUs 33种, Pro_JWJT组特有OTUs 29种。见图2。

表1 两组患者治疗前后IBS-SSS评分比较

图1 测序数据稀释曲线

注:Normal为健康对照;Pre_BL为地衣芽孢杆菌治疗前;Pro_BL为地衣芽孢杆菌治疗后;Pre_JWJT为加味交泰丸治疗前;Pro_JWJT为加味交泰丸治疗后

3.3 菌群多样性分析 采用α和β多样性分析评价菌群的整体结构。α多样性的Chao1指数评估表明,健康对照组的α多样性均显著高于其他4组(P<0.05),地衣芽孢杆菌治疗后α多样性有升高的趋势,而加味交泰丸治疗对α多样性无明显影响。β多样性分析中,PLS-DA显示健康对照组的菌群分布与其他4组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),但地衣芽孢杆菌及加味交泰丸治疗没有显著改变菌群的β多样性。见图3、图4。

注:Normal为健康对照;Pre_BL为地衣芽孢杆菌治疗前;Pro_BL为地衣芽孢杆菌治疗后;Pre_JWJT为加味交泰丸组治疗前;Pro_JWJT为加味交泰丸组治疗后

注:Normal为健康对照;Pre_BL为地衣芽孢杆菌治疗前;Pro_BL为地衣芽孢杆菌治疗后;Pre_JWJT为加味交泰丸治疗前;Pro_JWJT为加味交泰丸治疗后

3.4 菌群相对丰度 在门水平上,健康对照组主要由Firmicutes(厚壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)组成,而其他4组主要由厚壁菌门、Proteobacteria(变形菌门)、放线菌门组成,且加味交泰丸及地衣芽孢杆菌治疗前后主要菌门未发生显著变化。见图5。在属水平上,加味交泰丸治疗显著增加了优势菌Eubacterium_eligens_group、Flavonifractor及Lachnospira的相对丰度,降低了优势菌Eysipelotrichaceae_UCG-007、Scardovia及Senegalimassilia的相对丰度;地衣芽孢杆菌治疗显著增加了优势菌Peptoclostridium的相对丰度,降低了优势菌Collinsella、Lactococcus及Streptococcus的相对丰度。见图6、图7。

注:Normal为健康对照;Pre_BL为地衣芽孢杆菌治疗前;Pro_BL为地衣芽孢杆菌治疗后;Pre_JWJT为加味交泰丸治疗前;Pro_JWJT为加味交泰丸治疗后

注:Pre_JWJT为加味交泰丸治疗前;Pro_JWJT为加味交泰丸治疗后

3.5 LEfSe(LDA Effect Size)分析 在各分类学水平通过LEfSe分析后进行5组之间的比较,选取P<0.05且LDA 评分>3的物种,按照门、纲、目、科、属5个层级进化分支树绘图,见图8。图中所示,健康对照组富集的菌群主要归类于拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria);地衣芽孢杆菌治疗前富集的菌群主要归类于杆菌纲(Bacilli);地衣芽孢杆菌治疗后富集的菌群主要归类于变形菌门(Proteobacteria);加味交泰丸治疗前富集的菌群主要归类于毛螺菌科(Lachnospiraceae);加味交泰丸治疗前后富集的菌群主要归类于梭杆菌门(Fusobacteria)。结果表明,加味交泰丸及地衣芽孢杆菌治疗均显著改变了肠道菌群的结构,但两者改变的菌群不同,同时治疗后的菌群也与健康对照组有所差异。

注:Pre_BL为地衣芽孢杆菌治疗前;Pro_BL为地衣芽孢杆菌治疗后

4 讨论

IBS-D是消化内科的常见病及多发病,近年来发病率逐年上升。目前,现代医学治疗IBS-D主要以缓解症状为目的,但存在不良反应多、远期疗效差等弊端,导致患者在长期缓解疼痛或不适的治疗中获益较少,治疗效果不理想。因此,急需寻找补充或替代药物[10]。而中医药治疗IBS-D具有相对优势,并取得良好的疗效[11-12]。

中医学中并无IBS-D的病名,根据相关临床症状及特点,可将其归属于中医“泄泻”“腹痛”“郁证”范畴,其病因有感受外邪、饮食所伤、情志失调及脏腑虚弱等,脾胃功能障碍是本病发生的关键。脾虚湿胜是导致本病发生的重要因素。外因与湿邪关系较大,湿邪侵入,损伤脾胃,运化失常。内因则与脾虚关系最为密切,脾虚失运,水谷不化精微,湿浊内生,混杂而下,发为本病。近年来,有学者认为IBS外在表象为肝郁脾虚,其内在本质实为心肾不交,以心肾不交论来指导治疗IBS,可进一步丰富临床治疗的思路和方法[13]。

注:Normal为健康对照;Pre_BL为地衣芽孢杆菌治疗前;Pro_BL为地衣芽孢杆菌治疗后;Pre_JWJT为加味交泰丸治疗前;Pro_JWJT为加味交泰丸治疗后

交泰丸及其加味方是治疗心肾不交的经典方剂,主治胸中痞闷嘈杂。大便稀则胸中畅快,大便坚则痞闷难当,不思饮食,出现心火偏亢、心肾不交,表现为怔忡、失眠等症。心火亢盛、肾阳不足可导致心肾不交。欲使心肾相交,则必须既清心泻火以使心火下降,又当扶助肾阳以鼓舞肾水上承。只有水火相济,才能心肾相交。加味交泰丸作为交泰丸和痛泻要方的综合药方,具有全面综合的治疗效果,能改善患者生活质量,降低IBS-D严重程度。方中黄连、肉桂使心肾相交,黄连清心泻火以制偏亢之心阳,肉桂温补下元以扶不足之肾阳;心火不炽则心阳自能下降,肾阳得扶则肾水上承自有动力。本研究结果显示,治疗后中药组IBS症状严重程度较西药组显著改善,说明加味交泰丸可以通过“心肾相交”明显缓解IBS-D患者的临床症状。

IBS-D是由多种病理生理机制引起的,主要包括遗传和心理因素、胃肠动力异常、内脏感觉异常、饮食习惯、肠道菌群等因素[14-15]。目前已有较多研究[16]表明,本病与肠道菌群密切相关,肠道菌群的变化可能导致肠道通透性增加,诱发内脏过敏,激活免疫反应,进而引起胃肠道功能紊乱。近年来,高通量测序已广泛应用于IBS的肠道菌群研究。研究[17]显示,IBS患者的肠黏膜和粪便菌群的多样性均减少。而且随着病情的发展,IBS-D变得更加复杂。在IBS-D患者肠道微生态失调的情况下,临床治疗应重视对肠道菌群的调整,以提高治疗效果,促进患者康复[18]。

本研究中,与健康对照组比较,IBS-D患者肠道中拟杆菌门及放线菌门的丰度显著降低,而变形菌门的丰度显著增加,这与之前的报道结果一致[19-20]。但在中药及西药治疗后,α多样性及主要的菌门丰度无显著改变,这可能与研究人群的长病程及实验观察的时间有关。本研究的研究对象都是成年人,菌群结构比较稳定,而且IBS-D的平均病程较长,而实验观察的时间仅为28 d,考虑短期的干预很难彻底改变肠道菌群的总体结构。但在菌属的水平上,中药及西药治疗均在一定程度上改变了菌群的构成。

中药组Eubacterium_eligens_group、Flavonifractor及Lachnospira的相对丰度显著增加,Eubacterium_eligens_group及Flavonifractor与IBS-D的相关性报道较少。目前研究发现,Eubacterium_eligens_group丰度的增加与压力应激下的心理健康相关并具有抗炎作用[21],而Flavonifractor的较低丰度与情感障碍相关[22]。Lachnospira作为一种产生丁酸盐的梭菌簇XIVa物种,对IBS-D发挥保护性作用。对于在加味交泰丸治疗后相对丰度显著减少的Eysipelotrichaceae_UCG-007、Scardovia及Senegalimassilia,其中Eysipelotrichaceae与免疫介导的炎症性肠病密切相关[23],尚未报道Scardovia及Senegalimassilia在炎症性疾病中的作用。这些结果表明,加味交泰丸可以通过改变IBS-D患者的肠道菌群发挥治疗作用,并且这种作用可能与抗压力应激、抗炎症反应等相关。西药组Peptoclostridium的丰度显著增加,优势菌Collinsella、Lactococcus及Streptococcus的相对丰度降低,其中Collinsella与全身性炎症相关[24],而Streptococcus也与感染及炎症反应相关[25]。地衣芽孢杆菌治疗同样可以改变IBS-D患者的肠道菌群,并且肠道菌群的改变与炎症反应相关。

总的来说,加味交泰丸虽然对IBS-D患者肠道菌群多样性无显著影响,但其可以改变肠道菌群的结构和组成,与西药地衣芽孢杆菌的作用有所不同。另外,加味交泰丸治疗无法逆转IBS-D引起的肠道菌群的失调。本研究为加味交泰丸在临床的应用提供参考价值,但关于加味交泰丸的作用机制尚需进一步研究。