LC-MS/MS 法测定脆肉鲩鱼肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的残留量

◆作者：罗敏意

◆单位：中山市小榄镇农业服务中心

氯 霉 素（chloramphenicol）、甲砜霉素（thiamphenicol）、氟苯尼考（florfenicol）是一种酰胺醇类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有较好的抑制作用，曾被广泛用于畜禽和水产养殖业。然而，氯霉素可引起再生障碍性贫血、灰婴综合征等严重不良反应，我国农业农村部第250号公告明令禁止食品动物中检出氯霉素及其盐、酯。甲砜霉素和氟苯尼考在不同的动物源性食品中限量不同。

目前，国内已有畜禽产品和水产品等动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量测定的研究，而脆肉鲩鱼肉中上述目标组分残留量测定方法尚未见报道。中山市脆肉鲩养殖面积约3 万亩，占全省脆肉鲩养殖面积约90%，为此，在中山市开展脆肉鲩鱼肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量测定方法的研究具有重要意义，对日常风险监测及监管都有重要意义，也为脆肉鲩中其它抗生素类药物残留测定方法的建立提供参考（李盛安等，2022；董梅等，2022）。

1 仪器与试剂

液相色谱- 串联质谱仪（QQQ6430，安捷伦科技有限公司）；电子天平（300JJ，常熟市双杰测试仪器厂）；高速冷冻离心机（H1850R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；匀浆机（T18 basic，广州仪科实验室技术有限公司）；旋转蒸发仪（R-210，瑞士步琪有限公司）；旋涡混合器（945601，美国Talboys 公司）；塑料离心管（50 mL，常德比克曼生物科技有限公司）；鸡心瓶（100 mL，北京博美玻璃有限公司）；具塞三角瓶（250 mL，北京博美玻璃有限公司）。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷（色谱纯，美国默克公司）；氯化钠（AR，广州化学试剂厂）；C18 固相萃取小柱（500 mg，6 mL，CNW 公司）；0.22μm 尼龙针式过滤器（上海安谱实验科技股份有限公司）。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-D5标准溶液均为坛墨质检科技股份有限公司。

2 实验方法

2.1 样品提取

称取5 g 已均质的脆肉鲩鱼肉（精确至0.01 g），置于50 mL塑料离心管中，加入100μg/mL氯霉素- D5内标工作液250μL，再加入5 mL 乙腈和5 mL 4%氯化钠水溶液，涡旋振荡2min，10℃9000 r/min 离心5 min，将上层液体转移至另一塑料离心管，加入10 mL 正己烷，涡旋振荡1 min，10℃9000 r/min 离心5 min，弃上层液体后加入5 mL 水饱和乙酸乙酯，涡旋振荡1 min，10℃9000r/min 离心5 min，将上层液体转移至鸡心瓶，45 ℃200 bar旋蒸至干，加入4 mL5%乙腈水（V∶V=5∶95）复溶，备用。

2.2 样品净化

C18 固相萃取小柱分别用5 mL 甲醇和5 mL 水活化，样液（2.1）过小柱，用3 mL 超纯水洗涤小柱，挤干小柱后加入2.5 mL 50%甲醇水（V∶V=1∶1）洗脱，收集洗脱液并取适量过0.22 μm 滤膜后，供LC-MS/MS 测定。同时，做样品空白试验。

2.3 测定

2.3.1 液相色谱条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18，46 mm ×100 mm，18-Microm；柱温：40 ℃；流动相：A 为甲醇，B 为超纯水；流速：0.60 mL/min；进样量：20μL。分离氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相洗脱梯度条件

2.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：-400 V；干燥气温度：350 ℃，干燥气流速11 L/min；雾化器压力：40 psi；其他质谱参数见表2，特征离子质量色谱图见图1。

图1 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-D5 特征离子质量色谱图

表2 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素-D5 的质谱参数

3 结果与分析

3.1 前处理方法的选择

朱志伟等（2007）研究表明，脆肉鲩鱼肉中富含脂肪和蛋白质，其粗蛋白、脂肪和灰分含量均比普通草鱼高，水分含量则低于普通草鱼。为更好地去除鱼肉中的脂肪和蛋白质，本文比较了多种提取净化方法，最终选择了乙腈水提取、正己烷除脂、乙酸乙酯反萃取的方法对脆肉鲩鱼肉进行前处理，有效去除鱼肉中的脂肪和蛋白质等成分，提高了目标组分的提取效率。此外，样品提取、净化效果良好，不仅延长了色谱柱的使用寿命，也减轻了仪器维护的压力，节约了实验成本。

3.2 线性回归方程和检出限

配制浓度分别为0.1，0.5，1，2，5，10μg/L 的系列空白基质混合标准溶液，加入适量内标工作液，上机测定。以标准溶液中目标组分和氯霉素-D5峰面积的比值为纵坐标，以浓度比为横坐标，计算绘制标准工作曲线。

采用信噪比的方法来评估方法检出限，当目标组分的特征离子峰与基线噪音值的比值＞3时为方法检出限，信噪比＞10 为方法定量限（李龙，2022）。

目标组分的线性回归方程、相关系数R2、方法检出限及方法定量限见表3。结果表明，在0.1～10 μg/L 范围内线性回归方程呈良好的线性关系，相关系数R2均大于0.999，方法检出限均为0.1μg/kg，方法定量限均为0.3μg/kg，能满足日常大批量脆肉鲩鱼肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量测定的需要。

表3 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的线性回归方程、相关系数、方法检出限及方法定量限

3.3 方法回收率和精密度

称取5 g 不含氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的脆肉鲩鱼肉于50 mL 塑料离心管中，添加高、中、低3 个水平（25.0，12.5，7.5 ng）的标准溶液进行加标回收实验，每个添加水平重复6 次。结果表明，目标组分的加标回收率在80.3%～103%，相对标准偏差（RSD）在0.766 %～3.27 %，该方法具有良好的回收率和精密度（详见表4）。

表4 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的平均加标回收率及精密度

3.4 实际样品的测定

采用本文建立的LC-MS/MS法测定中山市鱼塘养殖的30 份脆肉鲩鱼肉样品，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考均未检出。

制备加标脆肉鲩鱼肉样品进行测定，样品中各目标组分能被有效分离，基本无杂峰干扰，回收率较高，说明该方法运用到实际样品测定中能得到较好的实验效果。

4 结论与讨论

本文建立了脆肉鲩鱼肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量的LC-MS/MS 测定方法。该方法具有提取效高、定量准确及节约成本等优点。本文选择合适的试剂、耗材对样品前处理步骤进行优化，选用合适的色谱柱和质谱测定条件，有效分离目标组分，大大提高了测定准确率，能满足日常大批量检测的需要，也为其它抗生素类药物残留测定方法的建立提供参考。

参考文献：（略）