种曲接种量对酱油制曲及发酵的影响

黄佳玲，刘建华，刘艳梅，苏燕文

（广东厨邦食品有限公司，广东阳江 529500）

酱油酿造主要包含制曲与发酵两大过程，制曲过程是酱油酿造的重要环节。米曲霉在制曲过程中发挥着重要作用，其分泌产生的各种酶，为酱油发酵的原料分解、物质转化合成奠定了基础[1]。酱油制曲过程中蒸料时间、米曲霉接种量、制曲温度、制曲时间对成曲品质指标（蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力）均具有影响，其中接种量对蛋白酶比活力的影响最大[2]。酱油制曲用的米曲霉一般是由其母种经过3～4代扩大培养而来，统称为种曲。种曲是酱油生产制曲的种子，种曲制作的主要目的是为酱油生产提供大量种子，即孢子[3]。但不同菌株产孢子能力不同，即使使用相同菌株培养所得的种曲，其孢子数也有很大不同[4]。实际生产中，为便于生产操作控制落实，制曲过程接入种曲时，往往是以培养种曲用的对应干物料的重量计算种曲重量，此时接入的种曲量虽相同，但不同培养工艺培养所得种曲本身的干基孢子数仍存在较大差异，会导致制曲接入的有效孢子数差异较大，进而可能会导致不同批次间制曲的质量产生较大波动，不利于产品品质的稳定。因此，需要找到制曲过程中种曲（米曲霉孢子）有效接种量的最优控制水平，用以控制生产并提升产品的质量与稳定性。

本文采用不同米曲霉孢子有效接入量进行酱油制曲与发酵，跟踪监测不同时间曲料感官、制曲酶活的高低及不同时间发酵过程中常见理化指标，以期为企业大生产中的种曲接种量的控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与原料

菌种，广东厨邦食品有限公司自培米曲霉三角瓶菌种；制曲与发酵过程所用原材料麸皮、黄豆、小麦、食用盐，均从市场采购。

1.2 仪器与设备

IKA RH磁力搅拌器，广州绿百草科学仪器有限公司；25×16血球计数板，上海求精生化试剂仪器有限公司；E100显微镜，南京江南永新光学有限公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；KDC-2C型微量凯式定氮仪，上海纤检仪器有限公司；Biochrom 30+全自动氨基酸分析仪，英国柏楉有限公司；200 kg种曲机，江苏华晖环保科技有限公司；发酵池，广东厨邦食品有限公司设计自制；65 m³发酵罐，连云港中复连众复合材料集团有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 种曲培养方法

麸皮原料直接均匀按1.0～1.5 cm的厚度装满曲盘后，放入种曲机；以180～200 mL·min-1的喷水量补湿25～30 min，同步开启种曲机风机；启动种曲机的自动灭菌与冷却功能，自动通入蒸汽升温至120～125 ℃，保压灭菌25～30 min对麸皮培养基进行灭菌，而后自动冷却使培养基的温度降至35～40 ℃；接入（6±2）‰的三角瓶菌种，并同步开启种曲机风机20～30 min，接种完毕；控制加湿喷头的喷水量在270～300 mL·min-1对接种后的培养基加湿（120±5） min，同步开启种曲机风机；通过种曲机的自动培养程序进行自动控温、加湿和通风，同时整个培养过程中种曲机风机需保持一直开启。其中，培养温度为28～36 ℃，通风量为5～7 m³·h-1，以180～200 mL·min-1的喷水量间断性加湿培养至72 h，最终培养获得成熟种曲[5]。

1.3.2 种曲有效接种量对酱油制曲的影响

将按1.3.1种曲培养方法培养所得的种曲依据其干基孢子数折算为60亿个/g、80亿个/g、100亿个/g、120亿个/g和140亿个/g不同干基孢子数的种曲（折算方法详见表1），再统一以3‰（W/W）的接种量将折算后种曲接入制曲原料进行大曲培养。其间，培养至第15～16 h进行第一次翻曲，继续培养至第21～24 h进行第二次翻曲，培养至44 h获得成熟大曲[6]。每组试验需记录第一、二次翻曲时曲料与成熟大曲的感官状态，并以其感官、大曲中性蛋白酶活为判定依据，初步确定制曲适宜的种曲有效接种量。

表1 不同干基孢子数种曲的折算方法

1.3.3 种曲有效接种量对酱油发酵的影响

将1.3.2试验中初步确定的制曲适宜的种曲有效接种量对应组别的成熟大曲分别与2.2倍20%的盐水混合制醪，以相同投料量和投料时间分别投入65 m³发酵罐，参照广式高盐稀态酱油酿造的常规工艺进行发酵。在发酵至10 d、20 d、30 d、60 d、90 d和120 d，分别取其发酵液检测总酸、氨基酸态氮、全氮、还原糖等常规指标进行跟进验证，再结合1.3.2试验结果进一步确认制曲适宜的种曲有效接种量。

1.3.4 在广式高盐稀态酱油酿造工艺中的应用试验

以成熟大曲的感官、中性蛋白酶活及其90 d发酵液氨基酸态氮与全氮为主要指标、90 d发酵液总酸、还原糖为参考指标，验证1.3.2与1.3.3共同确认的种曲有效接种量应用于广式高盐稀态酱油酿造工艺中制曲与发酵的稳定性。按照1.3.1种曲培养方法制备种曲，再按照1.3.2的制曲工艺制备成熟大曲（制曲接种量按照1.3.2与1.3.3共同确认的种曲有效接种量执行），而后按照1.3.3的发酵工艺进行发酵，发酵至120 d取其发酵液进行检测。上述试验共开展10批次平行试验，以验证其在大生产中的稳定性。

1.3.5 数据测定方法

孢子数测定参照《孢子数测定法》（SB/T 10315—1999）[7]；中性蛋白酶活测定参照《蛋白酶活力测定》（SB/T 10317—1999）[8]；总酸含量参照《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》（GB 12456—2021）[9]，采用第三法自动电位滴定法测定；氨基酸态氮含量测定参照《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》（GB 5009.235—2016）[10]；还原糖含量参照《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》（GB 5009.7—2016）[11]，采用直接滴定法测定。

2 结果与分析

2.1 种曲有效接种量对酱油制曲的影响

米曲霉的接种量对酱油制曲的质量，特别是其关键指标蛋白酶活有一定影响。在大生产中，制曲接入的种曲量相对固定，但当种曲的孢子数不同时，其不同批次有效米曲霉孢子接入量亦不相同，可能会对制曲质量产生影响。试验通过将种曲折算为不同干基孢子数的种曲，再按统一的接种量制曲（实际接入的有效孢子数不同），从而验证确定制曲适宜的种曲有效接种量，试验结果见表2。

表2 种曲有效接种量对酱油制曲影响的试验结果

由表2可知，随着制曲接种的折算后种曲干基孢子数的升高，米曲霉的生长速度逐步加快，开始产生孢子的时间亦有所提前，成熟大曲的孢子量明显上升。当制曲接种的折算后种曲干基孢子数达到140亿个/g时，米曲霉生长速度最快，在第二次翻曲时曲料的孢子量已到达生产可接受水平的上限，而成熟大曲感官孢子丰满、孢子量远超出生产可接受水平；当制曲接种的折算后种曲干基孢子数在120亿个/g及以下时，成曲孢子量最多为3个+的水平，均处于生产可接受水平。成熟大曲的中性蛋白酶活则整体呈现先快后慢的上升趋势，在制曲接种的折算后种曲干基孢子数为120亿个/g时，成熟大曲中性蛋白酶活达到最大值（2 757 U·g-1）；制曲接种的折算后种曲干基孢子数继续提升至140亿个/g时，成熟大曲中性蛋白酶活为2 682 U·g-1，略有下降。这可能是因为种曲有效接种量过大，会引起品温上升相对较快，易结块，不利于通风供氧，营养物质消耗过快，影响米曲霉的生长代谢，导致产酶量降低。结合生产经验，暂定制曲适宜的种曲有效接种量为接种3‰折算为80～120亿个/g干基孢子数的种曲。

2.2 种曲有效接种量对酱油发酵的影响

分别采用1.3.2试验中制曲接种量为接种3‰折算后干基孢子数为80亿个/g、100亿个/g、120亿个/g的种曲培养所得成熟大曲与盐水混合制醪，而后发酵晒制，并跟进发酵过程中不同天数发酵液的总酸、氨基酸态氮、全氮、还原糖等评价发酵质量优劣的主要指标。

2.2.1 发酵过程总酸的动态变化

由图1酱油发酵过程中总酸的动态变化可以看出，酱油发酵过程中，不同组别总酸含量均是在发酵前90 d快速上升，90 d时基本达到最高水平，而后维持在一个相对稳定的状态。120 d总酸含量有小幅下降，可能是因为某些微生物可以将有机酸转化为其他次级代谢产物[12]。总酸是酱油品鉴的风味物质，且与产品货架期的体态稳定性相关，总酸过低会导致酱油体态不稳定，析出絮状杂质或晶体，且影响酱油防腐效果；总酸过高会导致产品发酸，影响其风味的柔和性，并掩盖发酵酱油本身的酱香味[13]。因此，结合生产经验，种曲有效接种量优选为接种3‰折算为80亿个/g、100亿个/g干基孢子数的种曲。

图1 酱油发酵过程中总酸的动态变化

2.2.2 发酵过程氨基酸态氮与全氮的动态变化

全氮是酱油中可溶性含氮化合物的总称，包括原料溶出的蛋白质、发酵过程蛋白酶解产生的游离氨基酸、多肽氮、微生物自溶释放的核酸类水解物等，是衡量原料利用率与酱油发酵品质的重要指标之一。氨基酸态氮则是指以氨基酸形式存在的氮，也是全氮的一部分，更是区分不同级别酱油的核心指标之一。发酵过程中氨基酸态氮与全氮的动态变化分别见图2、图3。

图2 酱油发酵过程中氨基酸态氮的动态变化

图3 酱油发酵过程中全氮的动态变化

由图2、图3可以看出，酱油发酵过程中，不同组别氨基酸态氮均呈现持续上升的趋势，60 d后上升幅度逐渐变缓，发酵至120 d时，3组酱油的氨基酸态氮含量分别为1.03 g/100 mL、1.07 g/100 mL、1.07 g/100 mL，均达到国标中对特级酱油的要求。3组中，制曲接种的折算后种曲干基孢子数为100亿个 /g与120亿个/g的组别，其不同发酵天数的氨基酸态氮均高于制曲接种的折算后种曲干基孢子数为80亿个/g的组别。3组酱油发酵液的全氮含量均呈现为在30 d前快速上升，30 d之后缓慢增加/维持相对稳定水平的趋势，最终发酵结束时，3组酱油全氮含量分别为1.57 g/100 mL、1.58 g/100 mL、1.58 g/100 mL，3组全氮水平相当、无明显差异。整体来看，制曲接种的折算后种曲干基孢子数为100亿个/g与120亿个/g的组别，发酵过程全氮溶出与氨基酸生成的速率较快，发酵结束时氨基酸态氮相对较高，但对全氮的最终积累无优势。因此，种曲有效接种量优选为接种3‰折算为100亿个/g、120亿个/g干基孢子数的种曲。

2.2.3 发酵过程还原糖的动态变化

在发酵过程中，淀粉质原料在糖化酶、淀粉酶等的作用下被分解为还原糖，酱油的口感、风味、色泽等都与还原糖含量密切相关[14]。发酵过程中还原糖的动态变化见图4。

图4 酱油发酵过程中还原糖的动态变化

由图4可以看出，酱油发酵过程中，3组酱油发酵液还原糖含量均呈现先上升后逐渐降低的趋势，在发酵至第20 d时，3组酱油发酵液的还原糖含量均达到最大值，分别为6.70 g/100 mL、5.67 g/100 mL、5.35 g/100 mL。这主要是发酵前期淀粉酶等活力尚处于旺盛期，可以快速将淀粉质原料水解成葡萄糖、麦芽糖等还原糖，且此时还原糖的消耗速度较低，所以前期还原糖含量快速上升至最高值。20 d之后，随着发酵的持续进行，乳酸菌、酵母菌等微生物逐渐发展为优势菌群，将前期积累的还原糖进一步分解代谢为酸类、醇类、酯类等次级代谢产物，故而导致还原糖含量下降。发酵结束时，3组酱油的还原糖含量分别下降至5.10 g/100 mL、4.33 g/100 mL、3.25 g/100 mL，第3组酱油的还原糖含量最低，这可能是由于第3组的有效接种量最多，接种量过大导致制曲过程对淀粉质的消耗过多所致。结合产品品质控制的需求与生产经验，种曲有效接种量优选为接种3‰折算为80亿个/g、100亿个/g干基孢子数的种曲。

综合以上理化指标，3组中第2组酱油的各项指标均能达到生产所需的优选水平，因此可继续以制曲接种3‰折算后干基孢子数为100亿个/g的种曲进行后续应用试验。

2.3 优选种曲有效接种量应用试验

按照2.2中最终确定的优选种曲有效接种量在广式高盐稀态酱油酿造工艺中开展应用试验，其试验结果见表3。

表3 优选种曲有效接种量应用试验结果

由表3可知，按照制曲接种3‰折算后干基孢子数为100亿个/g的种曲进行酱油制曲与发酵应用试验，其培养所得成熟大曲的整体感官菌丝丰满、孢子量适中，均在生产可接受水平内，大曲中性蛋白酶活均在2 000 U·g-1以上的较高水平；所得的大曲进行酱油发酵时，其120 d酱油发酵液的总酸含量均值为1.79 g/100 mL，氨基酸态氮含量均值为1.08 g/100 mL，全氮均值为1.59 g/100 mL，还原糖均值为4.45 g/100 mL，各项理化指标均能达到前期试验的优选水平及以上，整体质量水平优良稳定。

3 结论

本文考察了不同种曲（米曲霉孢子）有效接种量对酱油制曲与发酵的影响，结果表明，随着种曲有效接种量的提升，在制曲时，成熟大曲的中性蛋白酶活整体呈先上升后稳定的趋势，接种量提升能够促进米曲霉加快生长，但提升较多会导致制曲过程产孢子时间大大提前，甚至成熟大曲的孢子量超出生产可接受水平，就生产而言，孢子数过多可能影响工人操作，同时也不便于后期清洁[15]。在试验范围内，种曲有效接种量相对较低的试验组，发酵结束时，其总酸与还原糖含量相对较高，能够达到生产较优水平；而种曲有效接种量相对较高时，发酵过程全氮溶出与氨基酸生成的速率较快，特别是发酵前期，发酵结束时氨基酸态氮的积累量相对较高，但对全氮的最终积累量无优势。综合来看，种曲有效接种量优选为制曲接种3‰折算后干基孢子数为100亿个/g的种曲。使用该种曲有效接种量进行制曲，培养所得大曲的中性蛋白酶活可稳定达到2 000 U·g-1以上的较高水平，且不会出现成熟大曲孢子量超出生产可接受水平的问题；进一步制醪发酵至120 d时，获得的酱油总酸含量均值为1.79 g/100 mL，氨基酸态氮含量均值为1.08 g/100 mL，全氮含量均值为1.59 g/100 mL，还原糖含量均值为4.45 g/100 mL，酱油品质能够达到国标中的特级酱油标准，品质优良。

为了生产便利，设定制曲原料总质量为Z，将种曲有效接种量优选为制曲接种3‰折算后干基孢子数为100亿个/g的种曲进行换算，即制曲接种时适宜的种曲使用量W=Z×3‰×100÷S（S为使用的种曲的干基孢子数）。如此，针对不同培养工艺/不同批次干基孢子数差异大的种曲，使用时直接套用上述公式计算出对应的种曲使用量进行接种，就可以确保制曲接入的种曲量不同，但接入的孢子量相同，从而提升了制曲的质量与稳定性，为不同培养工艺的种曲与同工艺孢子数差异较大的不同批次种曲在企业大生产中的种曲接种量控制提供了一种参考方案。