UPLC-MS/MS法测定鲫鱼中呋喃唑酮代谢物的不确定度评估

黎英权，朱伟霞

（广东宏科检测技术有限公司，广东惠州 516100）

呋喃唑酮（Furazolidone，AOZ）能抑制大多数的病毒和真菌生长，且价格便宜，所以水产养殖户们通常用其治疗一些由病菌引发的疾病[1-3]。然而，该药物有致癌风险，并会在食用动物体内长期残留，因此成了一种禁用兽药[4]。为确保超高效液相色谱质谱联用法测定AOZ残留量的准确性，检测实验室应根据JJF 1059.1—2012[5]、RB/T 214—2017[6]、CNAS—CL01：2018[7]等规定对测定过程开展不确定度评价。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

标准品：3-氨基-2-恶唑酮（AOZ，纯度99.32%、3-氨基-2-恶唑酮的内标物（AOZ-D4，纯度99.0%），德国Dr公司。

TRIPLE QUAD 4500液相色谱/串联质谱仪，美国AB SCIEX；FSJ-A03E1组织捣碎机，小熊电器；T25 easy clean digital均质器，德国IKA；3K15离心机，德国SIGMA；HGC-12A氮吹仪，天津恒奥科技；PX223ZH/E分析天平，奥豪斯仪器（常州）；移液器，德国BRAND；THZ-82恒温水浴摇床，国华（常州）仪器。

1.2 检测方法

鲫鱼样品按照《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法》（GB/T 21311—2007）进行预处理，使用超高效液相色谱串联质谱法（Ultra-High Performance Liquid Chromatography And Mass Spectrometry，UPLCMS/MS）检测。

1.3 呋喃唑酮代谢物标准使用液的配制

AOZ标准储备液（1 017 μg·mL-1）：准确称取0.025 60 g AOZ于25 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容；AOZ标准中间液（1.017 μg·mL-1）：用移液枪准确吸取AOZ标准储备液0.10 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容；AOZ-D4标准储备液（132 μg·mL-1）：准确称取0.001 32 g AOZ-D4于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容；AOZ-D4标准中间液（1.32 μg·mL-1）：用移液枪准确吸取AOZ-D4标准中间液1.0 mL至100 mL容量瓶中，乙腈定容；AOZ标准使用液：按照标准操作要求，配制基质标曲，最终AOZ标准使用液的浓度点分别为1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1。

2 结果与分析

2.1 数学模型

UPLC-MS/MS法测定试样中AOZ残留量采用标准曲线法定量，定量结果按公式（1）计算。

式中：X为鲫鱼中呋喃唑酮代谢物的含量，μg·kg-1；c为由标准曲线得出的供试品溶液中呋喃唑酮代谢物的浓度，ng·mL-1；V为最终定容体积，mL；m为称取鲫鱼的质量，g。

2.2 不确定度来源分析

UPLC-MS/MS法测定鲫鱼中AOZ残留量的不确定度主要来源为标准物质的称量和定容、鲫鱼样品的称取、样品重复测定、标准曲线的校准。

2.3 不确定度评定

2.3.1 配制标准溶液引入的相对标准不确定度urel,1(S)

（1）标准物质引起的相对标准不确定度urel,2(P)。查呋喃唑酮代谢物标准物质证书可得其扩展不确定度为1.73%（k=2），纯度为99.32%，算得相对标准不确定度平方为

（2）称量呋喃唑酮代谢物标准物质引起的相对标准不确定度urel,3(m)。根据电子天平检定证书，最大允许误差（Maximum Permissible Errors，MPE）为±0.05 mg，按矩形分布（）计算，称取呋喃唑酮代谢物标准物质0.025 60 g，其相对标准不确定度平方为

（3）使用移液枪和玻璃量具配制目标物标准储备液产生的相对标准不确定度urel,4(V1)。依据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[8]得，A级25 mL和50 mL容量瓶的最大容量允差分别为±0.03 mL和±0.05 mL，用到200 μL移液枪的最大容量允差为±3.0 μL，按三角分布（）计算定容产生的相对标准不确定度平方为

配制中间液，使用200 μL的移液枪，取50 μL储备液，乙腈定容至50 mL容量瓶，按照三角分布，该过程产生的相对标准不确定度平方为

使用移液枪和玻璃量具产生的相对标准不确定度平方为

（4）标准工作溶液配制过程中所用器量具引起的不确定度urel,8(V2)。由移液枪校准证书和《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[8]可知移液器、A级容量瓶的最大容量允差，按三角分布（）计算，可得使用移液枪、容量瓶引起的相对不确定度的平方（表1）。

表1 使用容量瓶引起的相对不确定度

移取10 μL AOZ-D4引起的相对标准不确定度平方为

标准工作溶液配制过程中所用器量引起的不确定度平方为

综上，可得配制标准溶液引入的相对标准不确定度平方为

2.3.2 鲫鱼样品预处理过程中引入的相对不确定度urel,10(Q)

（1）使用电子天平称取鲫鱼样品产生的相对标准不确定度urel,11(m)。由电子天平检定证书可知，该电子天平的称样量在0～50 000 mg时，最大允差为0.5 mg，因此当样品取样量为2.000 g时，由电子天平称量产生的相对标准不确定度的平方为

（2）样品处理过程中所用量器引入不确定度urel,12(V3)。最终定容时，使用1 000 μL移液枪，其最大允差为±10.0 μL，按三角分布考虑（），移取1 000 μL样品溶液进行定容，得到所用量器引入的相对标准不确定度平方为

移取10 μL内标溶液到样品中，使用的20 μL移液枪根据其检定证书可知最大允差为±0.8 μL，故其相对标准不确定度平方为

样品预处理过程中涉及量器引入的相对标准不确定度平方为

综上，检测鲫鱼样品中呋喃唑酮代谢物预处理过程中产生的相对不确定度的平方为

2.3.3 标准曲线拟合及样品重复测定产生的相对标准不确定度urel,15(C)

（1）鲫鱼样品重复测定引起的标准不确定度u(X)。在相同条件下，对一份阳性的样品进行6次重复测定，数据见表2。计算阳性样品中呋喃唑酮代谢物重复性测定引起的标准不确定度平方为

表2 样品重复性测定结果

（2）标准曲线拟合的标准偏差引入的相对标准不确定度urel,16(Y)。对呋喃唑酮代谢物标准使用液的每个标准点都测定3次,以校正点浓度为横坐标，呋喃唑酮代谢物峰面积响应值与呋喃唑酮代谢物内标峰面积响应值的比值为纵坐标，通过最小二乘法得到相关系数及一元回归方程，所得数据见表3。计算可得，目标化合物线性回归方程为y=1.121 7x+0.090 7；相关系数r=0.999 8。根据贝塞尔公式，标准曲线拟合的标准偏差（峰面积残差的标准偏差）引入的相对标准不确定度平方为

表3 3次测定的结果

合成标准不确定度平方为

合成相对标准不确定度平方为

2.4 合成相对标准不确定度

综合以上标准溶液配制过程、鲫鱼样品预处理过程、标准曲线拟合及样品重复测定过程引入的相对不确定度，可计算合成相对标准不确定度为

2.5 扩展不确定度

置信区间为95%时，包含因子k=2，相对扩展不确定度为Urel=2×0.032 8=6.56%；样品AOZ检出值为9.605 μg·kg-1，其扩展不确定度为U=9.605×6.56%=0.630 μg·kg-1。

3 结论

本文采用UPLC-MS/MS法检测鲫鱼中的AOZ，实验数据表明，当置信区间为95%时，包含因子k=2，所测鲫鱼中AOZ含量为9.605 μg·kg-1，扩展不确定度U为0.630 μg·kg-1。适当增加样品平行测定的次数和选用精度较高的量器都能很大程度地降低结果的不确定度，保证检测结果的准确性。