农药硫丹抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

□ 王兆芹 北京勤邦科技股份有限公司

硫丹是一种人工合成的有机氯化合物，广泛用作农药杀虫剂。由于该药物具有杀虫范围广、价格低廉、对蜜蜂低毒等优点，因此被广泛应用于防治棉花、果树、大豆、蔬菜、茶及烟草等各种农作物中的害虫。我国于20世纪90年代开始生产硫丹，到2011年，登记使用的硫丹产品有47种，涉及药企43家，称为该药物的第二大生产国。该药物有效期长，但具有生物富集作用，对鱼类、贝类等有较大危害性，对哺乳动物具有累积毒性，已有大量文献报道在蔬菜、水果等农作物中检测到硫丹残留。

目前，全球有70多个国家禁止生产和使用硫丹。根据我国农业部等五部委联合发布的1586号公告，撤销硫丹在苹果树和茶树中的登记。这就意味着硫丹不得继续在已撤销的作物中使用，并将逐步淘汰硫丹的生产和使用。

国内外对于硫丹的研究方法多采用固相萃取与气相色谱法检测。与这两种方法相比，免疫化学检测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可批量检测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学法检测硫丹的前提是需要具备针对硫丹的抗体，本文研究了硫丹人工抗原制备方法，并将其应用于酶联免疫试剂盒中，能够检测蔬菜、水果中的硫丹残留量，且具有用时短、操作简单、成本较低等优点，适用于基层单位大批量检测样品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

图1 硫丹半抗原合成

硫丹标准品（纯度≥95%）：北京标准物质研究中心；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）（分析纯）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）（分析纯）：美国Sigma公司；蔬菜、水果：超市。

MK3酶标仪（最大量程为4.0）：购自上海雷勃分析仪器有限公司；MX-F涡旋仪：湖南湘立科学仪器有限公司；HFJ-10均质器：湖南湘立科学仪器有限公司；JA2003电子天平：上海力辰仪器科技有限公司。

1.2 制备抗原

1.2.1 制备半抗原

取硫丹醇3.6 g，加1,4-二氧六环100 mL溶解，充分搅拌，后加入分子筛3.0 g，加琥珀半醛1.02 g，充分搅拌，通入盐酸气，避光室温搅拌5 h；停止反应，加入0.5 mol/L NaOH溶液，200 mL充分震荡，加乙酸乙酯200 mL，充分震荡，静置，分去水相，有机相加水80 mL洗涤，震荡后静置，分去水相，有机相无水硫酸钠干燥蒸干，上硅胶柱，二氯甲烷/甲醇（v/v，10/1）洗脱纯化，得到琥珀缩醛硫丹半抗原产物2.1 g，收率45.75%。

1.2.2 制备免疫原

取琥珀缩醛硫丹16 mg，加DMF 1 mL溶解，加NHS 18.7 mg，DDC 33 mg，室温反应3 h，得到半抗原溶液A液；取牛血清白蛋白（BSA）50 mg，加0.05 M PB缓冲液溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，4℃反应12 h，0.02 M PBS透析纯化3天，每天换液3次，得到硫丹-BSA偶联物，即为免疫原，-20℃保存，备用。

1.2.3 制备包被原

取琥珀缩醛硫丹10 mg，加DMSO 1 mL溶解，加NHS 6.7 mg，EDC 16 mg，室温反应3 h，得到半抗原溶液A液；取卵血清白蛋白（OVA）50 mg，加0.05M PB缓冲液溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，4 ℃反应12 h，0.02 M PBS透析纯化3天，每天换液3次，得到硫丹-OVA偶联物，即为包被原，-20 ℃保存，备用。

1.3 制备酶标记抗抗体

将“1.2”得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，产生抗血清，脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合、克隆，得到杂交瘤细胞株，纯化后得到硫丹单克隆抗体，进而免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体，将其与辣根过氧化物酶（HRP）偶联，最终得到酶标记抗抗体。

1.4 检测性能

1.4.1 计算检测限

分别检测20份黄瓜、苹果空白样本，利用空白样本浓度的平均值加上3倍标准差，计算检测限（LOD），即检测方法可检测出的最低被测物浓度。

1.4.2 精密度和准确度

分别对黄瓜、苹果样本添加硫丹，使黄瓜浓度达到50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg，使苹果浓度达到100 μg/kg、200 μg/kg和400 μg/kg，测定添加回收率，以此评价该试剂盒的准确度。同时，每个样本做4个平行，按照上述“1.4”制备3批酶标板，计算相对标准偏差（RSD%），以此评价该试剂盒的精密度。

1.4.3 测定稳定性

通过测定试剂盒的保存条件，评价该试剂盒的稳定性。将试剂盒保存于4℃，每个月测定一次最大吸光度值（0 μg/L）、IC50以及黄瓜、苹果样本的回收率，连续测定12个月。

1.4.4 测定抗体特异性

滴滴涕、水胺硫磷与硫丹同属于有机氯农药，结构类似，测定上述药物的IC50，根据下式计算该试剂盒对于滴滴涕、水胺硫磷的交叉反应率：

2 结果与分析

2.1 计算检测限

本研究对黄瓜样本的检测限为41.4 μg/kg，对苹果样本的检测限为85.1 μg/kg，见表1和表2。

表1 黄瓜的检测限测定（μg/kg）

表2 苹果的检测限测定（μg/kg）

2.2 精密度和准确度

按50 μg/kg、100 μg/kg两个浓度的硫丹对蔬菜样品进行添加回收测定，按100 μg/kg、200 μg/kg两个浓度的硫丹对水果样品进行添加回收测定，平均回收率分别为81.2%～92.3%，74.8%～87.9%；批内、批间相对标准偏差均小于15%。

2.3 测定稳定性

将试剂盒保存在4℃，测定的试剂盒的最大吸光度值（0μg/L）范围是1.55～1.83，50%抑制浓度范围是4.5～7.5 μg/L，硫丹添加回收率范围是71.8%～96.6%，由此可见，各指标均在正常范围之内。从测定结果可知，该试剂盒在4℃至少能够保存12个月。

2.4 测定抗体特异性

硫丹抗体与滴滴涕、水胺硫磷的交叉反应率见表3。由表3可知，硫丹抗体与滴滴涕、水胺硫磷的交叉反应率小于1%。

表3 交叉反应率试验

3 讨论

图2 勤邦制备的硫丹残留酶联免疫试剂盒

本研究制备了抗硫丹单克隆抗体，并研发出相应的ELISA试剂盒，本试剂盒对黄瓜的检测限为41.4 μg/kg，对苹果样本的检测限为85.1 μg/kg；回收率分别为81.2%～92.3%，74.8%～87.9%；批内、批间相对标准偏差均小于15%。硫丹单克隆抗体的特异性较好，与滴滴涕、水胺硫磷的交叉反应率小于1%。ELISA试剂盒能够在4℃下保存12个月，主要指标在正常范围内，可见稳定性较好。勤邦制备的硫丹残留酶联免疫试剂盒已投入市场，目前来看产品性能稳定，能够达到客户要求，为基层单位大批量地检测样品中是否残留农药硫丹提供了便捷的快速检测方法。