益生菌固体饮料对小鼠肠道调节作用的初步研究

李 英，岳林涛，张永杰，李 纳，王怡凡，关慧敏

（1.山西振东五和医养堂股份有限公司，山西长治 046000；2.药食同源功能食品山西省重点实验室，山西长治 046000）

益生菌是发挥有益作用的活性有益微生物的总称[1]，其无致病性，高度耐受胃酸和胆汁，能黏附于肠黏膜而阻止病原微生物的依附，有利于提高人体免疫力[2]。目前研究的益生菌以双歧杆菌、乳酸杆菌为主，还包括一些其他共生的细菌[2]。其主要生理功能包括调节肠道微生物平衡、改善肠上皮细胞屏障功能、调节免疫应答、促进消化吸收等[1]。本文对制备的益生菌固体饮料复合粉的肠道调节作用进行功效验证，为后期产品调整提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用KM小鼠150只，SPF级，雌性，体重17～20 g，购自河南省实验动物中心，许可证编号为SCXK(豫)2017-0001，批号为20211126，质量合格证编号为NO.410975211100058024。领取后于动物房适应性饲养1周，在此期间可自由饮水、进食，保持充足的日照和透风。环境保持清洁恒温，饲养环境平均温度、湿度分别为25 ℃、37%，15～20次/h全新风。饲料（批号：21093213）、垫料（批号：21089813），北京科澳协力饲料有限公司。

1.2 仪器与试剂

益生菌固体饮料（山西振东五和医养堂股份有限公司）；大黄（安国市兴华中药材有限公司）；2,4-二硝基氟苯、蓖麻油（麦克林）；丙酮（天津市风船化学）；D-木糖（阿拉丁）；D-木糖测定试剂盒（索莱宝）；a-淀粉酶试剂盒（南京建成）。

酶标仪（伯腾，EPOCH）；耳肿胀打孔器（原阳县振华教学仪器、YLS-Q4）；电子pH计（赛多利斯科学仪器，PB-10）；高速离心机（安徽中科中佳科学仪器，HC-2518）；电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器，DZKW）；单人双面垂直送风净化台（上海天恒医疗器械，JHT-315AB）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及剂量

将150只小鼠随机为5组，每组30只，5个组别分别为空白组、模型组和3个剂量组。3个剂量组小鼠益生菌固体饮料灌胃剂量分别设置为人体使用剂量的10倍、20倍、30倍，分别记为低（1 g·kg-1）、中（2 g·kg-1）、高（3 g·kg-1）剂量组。小鼠按剂量每天灌胃1次（灌胃量为0.3 mL/10 g bw，空白组灌胃等体积蒸馏水），连续灌胃28 d后对动物各项指标进行测定。

1.3.2 建立脾虚模型

制作100%大黄水煎液：取大黄药材适量，加10倍蒸馏水，煮沸后煎煮9 min，过滤，旋转蒸发浓缩至相当于生药材浓度1 g·mL-1，即得100%大黄水煎液，备用。

实验第4周建立脾虚小鼠模型，空白组给予等体积蒸馏水；模型组及剂量组小鼠灌胃给予100%大黄水煎液（0.1 mL/10 g bw），小鼠按剂量每天灌胃1次。造模组小鼠出现饮食减少、体重减轻、精神不振、畏惧光、喜欢抱团、皮毛杂乱无光泽和大便黏腻等情况，表示小鼠造模成功。造模成功后开始检测相关数据。

1.3.3 实验操作

（1）D-木糖含量检测。各组小鼠随机选取10只，末次给药1 h后，灌胃5% D-木糖溶液4 mL·kg-1，40 min后眼球取血，3 500 r·min-1离心10 min得血清，依照D-木糖测试盒说明方法测定。

（2）小鼠肠胃实验及淀粉酶活性检测。各组小鼠随机选取10只，末次灌胃后禁食不禁水，24 h后，给小鼠灌服营养性半固体糊（羧甲基纤维素钠10 g、奶粉16 g、淀粉8 g、糖8 g、活性炭3 g和蒸馏水100 mL）0.8 mL，于灌胃后30 min摘眼球取血后立即开腹，结扎胃贲门和幽门，取出小肠，剥离后直铺于白纸上，用直尺测量幽门到回盲肠的距离及幽门至黑色半固体糊推进前沿的距离，以黑色半固体糊推进的距离占幽门至回盲部距离的百分率为小肠推进率。剪去黑色半固体糊部分5 cm，放入5mL EP管中保存，待测pH值。取小鼠的胃，用滤纸擦干后称其全重，再沿胃大弯剪开胃，洗去胃内容物，称胃净重。胃全重与胃净重的差值为胃内残留物重量，以胃内残留黑色半固体糊占所灌胃黑色半固体糊的质量百分比为胃内残留率。将小鼠血液在3 500 r·min-1下离心10 min得血清，依照淀粉酶测试盒说明方法测定淀粉酶活性。

（3）益生菌固体饮料对免疫耳肿胀的影响。各组剩余小鼠10只，用剃毛器清理小鼠腹部皮毛（面积为3 cm×3 cm），将2,4-二硝基氟苯（2,4-Dinitrofluorobenzene，DNCB）溶液涂抹于小鼠腹部（50 μL/只），继续给药4 d后，将20 μL DNCB溶液涂抹于小鼠左耳两面进行致敏攻击，攻击24 h后颈椎脱臼处死小鼠，用直径8 mm打孔器打下左右两侧同部位的耳片，精密称重，以左右耳片质量之差为肿胀度。

1.3.4 数据处理

实验数据采用（）表示，使用SPSS 22.0统计软件分析，用单因素方差分析及T检验，P＜0.05代表有统计学差异。

2 结果与分析

由表1可知，模型组与空白组比较，模型组D-木糖含量、淀粉酶活性显著降低，耳肿胀度显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。剂量组与模型组比较，各剂量组D-木糖含量、高剂量淀粉酶活性显著升高，各剂量组耳肿胀度均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 小鼠D-木糖、淀粉酶活性、耳肿胀及肠胃检测结果

大黄水煎液可致小鼠腹泻，表现为胃部固摄能力减弱、肠道蠕动加快，导致肠道水分吸收减少，胃液下流，肠道pH降低。由表1可知，模型组与空白组比较，模型组肠推进率显著升高、胃残留率显著降低、小肠内容物pH值显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。剂量组与模型组比较，中、高剂量组肠推进率显著降低，中剂量组胃残留率显著升高，中、高剂量组小肠内容物pH值显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 结论与讨论

木糖是一种常见的五碳糖，不会存在于血液中，服用后由小肠吸收，肝脏不代谢，由肾脏排出，因此口服D-木糖可反映小肠吸收功能状况[3-4]。α-淀粉酶是肠液中的主要消化酶，由胰腺分泌，在小肠中保持较高的浓度[5]。徐复霖等[6]研究了两种不同脾虚造模方法对小鼠肠液分泌及淀粉酶活性的影响，发现大黄致虚可使淀粉酶活性降低。淀粉酶是一种非常重要的消化酶，淀粉酶如果分泌不足、活性降低，机体的消化功能就会受到影响[3]。小肠是消化管中最长的部分，是消化、吸收的主要部位，D-木糖和淀粉酶活性可反映小肠的消化吸收能力。

肠道菌群是一个相对比较复杂且非常活跃的微生态系统，数量和种类很庞大，与大多数疾病的发生、发展、转归等联系非常紧密，又被称为控制人体健康的“第二基因组”[7]。肠道的微环境稳态是保证肠道菌群稳定的外在表现，当肠道菌群平衡被打破，其环境也会出现变化。测定肠道内容物pH值，可间接观测肠道菌群稳态。

中医的脾是涉及消化吸收、水盐代谢、能量转化、血液、免疫及神经内分泌等多系统的综合功能单位，脾虚证即是这些系统功能降低的综合表现[8]。故脾虚证是以消化吸收功能低下为主的多器官和多系统功能减弱的综合病理变化[9]。过量或长期服用苦寒药（如大黄）会损伤脾胃、耗伤正气，而产生脾虚[9]。大黄性寒、味苦，主要功效是攻下积滞等；主要药效活性成分为蒽醌类、蒽酮类等；现代临床研究表明，大黄泻下作用是由于蒽醌代谢产生蒽酮，其泻下作用使得肠道菌群紊乱，大量有益菌属被排出，肠道内微生态平衡被打破，短时间内调节肠道正常蠕动的菌群难以恢复平衡所导致[10]。常见的肠推进及胃残留实验，可直观地观测肠胃功能变化。

实验结果表明，益生菌固体饮料可减缓由大黄水煎液灌胃导致的肠胃消化吸收能力下降，提高D-木糖含量和淀粉酶活性；可调节小鼠胃肠道蠕动能力，降低由大黄刺激性泻下作用导致的胃肠道异常蠕动；并可恢复肠道pH值，调节由于大黄作用有益菌属排出导致的肠道菌群失衡，恢复肠道菌群微生态平衡；并可降低小鼠耳肿胀度，提高免疫力。综上所述，益生菌固体饮料具有肠道调节作用，并可增强免疫力。