基于FRET的荧光猝灭法在食品检测中的应用

徐思凡

（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌 330052）

荧光法具有快速、操作简单和灵敏度高等优点，被广泛应用于结晶紫（Crystal Violet，CV）的检测。近年来，以金纳米簇为代表的纳米荧光材料获得越来越多的关注。金纳米簇的荧光性质与自身尺寸有关，当其粒径接近于电子的费米波长（0.5 nm）时，表现出类似分子的性质，如HOMO-LUMO跃迁和荧光特性等。随着金核数量的增加，荧光将会发生红移，这使金纳米簇具有可调节的荧光波长[1]。长波长发射的金纳米簇可以很好地降低生物自体的背景荧光干扰，为生物样品的实际检测提供了基础。此外，由于银原子拥有和金原子相似的尺寸和化学性质，故在金纳米簇合成过程中，银的加入使二者表现出协同效应，使双金属纳米簇表现出比单一金属纳米簇更大的尺寸以及更强的荧光和催化活性。因此，本文以生物质材料鸭蛋清为模板采用简单的微波法快速制备了具有长波长荧光发射的鸭蛋清金银纳米簇（Duck Egg White-AuAg Nanoclusters，DEW-AuAgNCs），并构建了一种基于FRET的检测水产品中残留CV的新方法，实现了CV的简单快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

结晶紫（2 mmol·L-1）：称取0.081 6 g CV粉末，用超纯水定容于100 mL容量瓶，再转移至棕色试剂瓶，4 ℃储存备用；六水合氯金酸（5 mmol·L-1）：称取HAuCl4·6H2O 0.205 6 g，用超纯水定容于100 mL容量瓶，再转移至棕色试剂瓶4 ℃储存备用；硝酸银（5 mmol·L-1）：称取0.042 4 g AgNO3，用超纯水定容于50 mL容量瓶，4 ℃储存于棕色试剂瓶。实验所用试剂全部为分析纯，实验用水为超纯水，电阻率≥18.25 MΩ·cm。

1.1.2 实验仪器

Luminous荧光分光光度计，美国赛默飞公司；UV2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN透射电子显微镜，美国FEI公司；Escalab 250Xi X射线光电子能谱仪，美国赛默飞公司；IRTracer-100傅立叶变换红外光谱仪，日本岛津公司；FLS980荧光光谱仪，英国爱丁堡公司；Nano ZS-90动态光散射纳米粒度分析仪，英国马尔文公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DEW-AuAgNCs的合成

以鸭蛋清、氯金酸和硝酸银为前体，采用一步微波法在1 min内快速合成DEW-AuAgNCs。取鸭蛋清置于锥形瓶中，磁力搅拌10 min，并超声20 min充分混匀。向锥形瓶中依次加入1.7 mL的鸭蛋清、2.4 mL的5 mmol·L-1HAuCl4和185 μL的5 mmol·L-1AgNO3溶液，磁力搅拌2 min后，逐滴加入800 μL的1 mol·L-1NaOH溶液，搅拌2 min，放入微波炉中，225 W反应1 min，得到深黄色液体。为去除未反应完的鸭蛋清、HAuCl4和AgNO3，采用50 KD截留量的超滤管4 000 r·min-1离心20 min对DEWAuAgNCs纯化处理，弃去滤出液，将浓缩液置于4 ℃避光储存。同时分别在不添加AgNO3和HAuCl4的条件下采用相同的方法合成DEW-AuNCs和DEW-AgNCs。

1.2.2 TEM表征

分别吸取适量的DEW-AuAgNCs溶液，滴加到铜网上，待完全干燥后，采用透射电镜观察DEWAuAgNCs的形貌、分布及粒径大小。

1.2.3 XPS表征

将载玻片裁成1 cm×1 cm大小的正方形，王水浸泡24 h后用大量超纯水清洗。将DEW-AuAgNCs滴加到载玻片上，放入真空干燥箱，待完全干燥后，采用X射线光电子能谱仪分析DEW-AuAgNCs的元素种类[2]。

1.2.4 红外表征

将鸭蛋清和DEW-AuAgNCs分别进行冷冻干燥处理，得到固体粉末，压片后上机扫描红外光谱。

1.2.5 结晶紫检测体系的建立

依次向pH值为5的NH4Ac-HAc缓冲液中加入50 μL DEW-AuAgNCs和50 μL不同浓度的CV标准溶液，放入恒温混匀仪中30 ℃反应5 min，上机扫描其荧光光谱。在380 nm激发波长下，记录682 nm处的荧光强度，并计算荧光猝灭效率（F0-F）/F0（F0和F分别为加入CV前后的荧光强度值）。以（F0-F）/F0为纵坐标，CV的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 实际样品的检测

于当地市场购买新鲜鲫鱼和草鱼，分别取适量鱼肉利用组织研磨仪粉碎后，准确称取5 g，加入13 mL乙腈并超声30 min，离心取上清液。向沉淀中再加入12 mL乙腈，再次超声30 min，离心取上清液。合并两次提取液，放入真空干燥箱挥干乙腈，再加入25 mL超纯水后检测其中的CV含量，并进行加标回收实验。

2 结果与分析

2.1 DEW-AuAgNCs的形成

以鸭蛋清为保护剂和还原剂，采用一步微波法合成了DEW-AuAgNCs。DEW-AuAgNCs的形成过程可分为3步。①在碱性条件下，HAuCl4和AgNO3可被蛋白质中具有还原性的成分（酪氨酸和半胱氨酸残基）还原为零价的金和银。由于AuCl4-的还原电势低于Ag+，故金的还原速度比银相对要快，因此被还原的Au原子先沉积形成金核[3]。②Ag+在先形成的金核表面形成金属键，同时金核催化了银核的沉积。③金核和银核共沉积从而形成合金核，并在蛋白质模板内部进一步聚集，形成了具有强荧光发射的金银纳米簇。

2.2 DEW-AuAgNCs的表征

采用透射电子显微镜观察了DEW-AuAgNCs的大小和形态。由图1（a）可以看出DEW-AuAgNCs在水溶液中分散均匀，形状为近球形，无核壳结构。图1（b）的粒径在1.0～2.6 nm，平均尺寸约为1.83 nm。图1（a）的内插图为DEW-AuAgNCs在高分辨率透射电镜下的晶格结构图，通过Digital Micrograph软件分析得DEW-AuAgNCs的晶格间距约0.19 nm。

利用傅里叶变换红外（Fourier Transform Infrared，FT-IR）研究了DEW-AuAgNCs的化学结构和形成机理。图2是鸭蛋清和DEW-AuAgNCs的FT-IR图，鸭蛋清和DEW-AuAgNCs的FT-IR光谱具有极为相似的吸收峰。3 298 cm-1处的吸收峰与O–H和N–H的伸缩振动有关，1 531 cm-1处归因于C-N的特征峰，1 649 cm-1处属于C=O的振动吸收峰，这证明了酰胺I带和酰胺II带的存在；在合成DEW-AuAgNCs前后，酰胺键的位置没有发生明显的变化，表明所合成的AuAgNCs被包裹在鸭蛋清中。合成DEWAuAgNCs后3 298 cm-1、1 649 cm-1和1 531 cm-1位置的峰强度均变弱，且3 298 cm-1的峰变宽，这表明AuCl4-和Ag+与蛋白质之间发生了相互作用，改变了蛋白质二级结构。

图2 DEW-AuAgNCs 的红外光谱图

2.3 DEW-AuAgNCs检测CV的原理

本文以廉价的生物质材料鸭蛋清为模板，采用微波法快速（1 min内）合成长波长发射的DEWAuAgNCs。合成的DEW-AuAgNCs在380 nm激发波长下，在682 nm处有最大荧光发射[4]。基于DEW-AuAgNCs与CV之间的FRET，DEWAuAgNCs的荧光被CV选择性地猝灭，据此本研究构建一种荧光猝灭法检测水产品中残留的CV，检测原理如图3所示。

图3 DEW-AuAgNCs的合成和荧光猝灭法检测CV的原理图

2.4 荧光猝灭机制的分析

常见的荧光猝灭机制有光诱导电子转移（Photoinduced Electron Transfer，PET）、静电相互作用、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）和内滤效应（Inner Filter Effect，IFE）。为探索CV猝灭DEW-AuAgNCs荧光的机制，通过紫外可见吸收光谱、荧光光谱、Zeta电位和荧光寿命等一系列表征来系统的验证。由图4（a）可以看出，在添加CV标准溶液后，DEW-AuAgNCs的紫外吸收峰位置没有明显改变，且未出现新的吸收峰，因此DEW-AuAgNCs和结晶紫反应后没有产生新的复合物排除PET。由图4（b）可以看出，DEWAuAgNCs、CV、DEW-AuAgNCs+CV的Zeta电位分别为-18.43 eV、-6.29 eV和-21.5 eV，DEWAuAgNCs和CV均带负电荷，故二者之间不会发生静电相互作用。通过扫描DEW-AuAgNCs的激发光谱、发射光谱和CV的紫外可见吸收光谱，由图4（c）发现，DEW-AuAgNCs的荧光发射光谱和CV的紫外可见吸收光谱有部分重叠，因此，二者之间可能发生了FRET或IFE。

图4 荧光猝灭机制验证过程

FRET是当供体荧光分子从激发态向基态跃迁时，释放的能量被受体分子吸收的能量转移现象。在FRET的过程中，供体分子本身荧光强度减弱，荧光寿命发生衰减，而受体分子荧光增加或不变。故FRET发生的前提是指供体的发射光谱与受体的紫外可见吸收光谱有重叠；二者的距离足够近（一般在10 nm内）；供体的荧光寿命发生衰减。IFE是指猝灭剂吸收荧光物质的激发或发射光，从而使荧光物质的荧光被猝灭的现象。在IFE过程中，猝灭剂的紫外可见吸收光谱与荧光物质的激发光谱或发射光谱重叠并且加入猝灭剂前后，荧光物质的荧光寿命不会改变[5]。FRET和IFE的主要区别在于在猝灭剂的存在下，体系的荧光寿命是否发生了变化。因此进一步检测了单独的DEW-AuAgNCs和添加CV后的荧光寿命。由图4（d）可以看出添加CV后体系的荧光寿命发生了明显的衰减。DEW-AuAgNCs的荧光寿命为405 ns，与结晶紫反应后，体系的荧光寿命衰减到282 ns，荧光寿命衰减了30.37%。以上的结果表明，CV猝灭DEWAuAgNCs荧光的机制是FRET。

2.5 实际样品分析

作为水产品养殖的杀菌剂，CV易富集在鱼类体内，对人体健康造成威胁。为进一步验证该方法的实用性，对草鱼和鲫鱼中CV的含量进行了检测，并做了加标回收试验。如表1所示，草鱼和鲫鱼中未检测到CV，向样品溶液中加入0.05 μmol·L-1、0.50 μmol·L-1和1.00 μmol·L-13个浓度的CV标准溶液，7次平行测定结果显示，加标回收率在98.00%～104.90%。因此，本研究构建的DEW-AuAgNCs荧光探针用于检测鱼类样本中的CV具有准确性和可靠性。

表1 鱼类样品中CV的检测结果表（n=7）

3 结论

基于FRET的传感方法具有快速和灵敏度高等优点，在药物、食品和环境检测领域有广阔的应用前景。新型纳米材料，如碳点、金属纳米簇、金属纳米粒子、上转换纳米粒子和二维层状纳米片具有优异的光学性质和生物相容性，是FRET体系荧光供体和受体的理想材料。此外核酸适配体和抗体等具有高度特异性，可利用这个特性大大提高传感方法的灵敏度。