左聚糖降解酶的研究进展

陈倩倩,赵紫琰,徐海洋,徐淋香

(1.江苏海洋大学 江苏省海洋生物资源与环境重点实验室,江苏 连云港 222005;2.江苏海洋大学海洋食品与生物工程学院,江苏 连云港 222005;3.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心,江苏 连云港 222005;4.江苏省海洋资源开发研究院,江苏 连云港 222005)

天然的果聚糖(fructan)包括左聚糖(levan)和菊粉(inulin)。左聚糖来源于单子叶植物和微生物,在鸭茅等禾本科以及菊科、百合科等多种植物中作为一种储存糖类来提供碳源和能量,但是含量较少,主要由微生物产酶催化蔗糖聚合而成[1]。左聚糖是由D-果糖构成的多糖,主链以β-2,6糖苷键连接,部分含有β-2,1连接支链,末端含一个葡萄糖残基,具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性,亦有抗氧化、抗肿瘤、消炎、降胆固醇、降血糖等生物活性,被广泛应用于食品、医疗、化妆品等领域[2-3]。

左聚糖降解酶(levan-degrading enzyme)是一类能水解β-2,6-D-果聚糖果糖苷键的酶。有3种类型,且同属于糖苷水解酶32家族(glycosyl hydrolases family 32),分别为左聚糖酶(levanase)[EC3.2.1.65]、左聚糖生物水解酶(β-2,6-fructan 6-levanbiohydrolase,LF2ase)[EC3.2.1.64]、左聚糖果糖转移酶(levan fructotransferase,LFTase)[EC4.2.2.16]。左聚糖酶将高分子量的左聚糖水解成短链的左聚糖型低聚果糖,左聚糖果糖转移酶是将左聚糖催化水解,从左聚糖为底物的非还原端切下2个果糖,通过分子间脱水,形成双果糖酐IV,而左聚糖生物水解酶将左聚糖催化生成果二糖或果糖[4]。

1 左聚糖降解酶的来源及性质

1.1 来源

左聚糖降解酶主要来源于微生物,尤其是细菌,对植物来源的左聚糖降解酶报道较少。2020年,Huang等[5]发现玉米中存在一种特异性水解左聚糖的外切水解酶,在植物生长和抵御细菌时发挥不同的调节作用。到目前为止,已经陆续发现了来自各种微生物的左聚糖降解酶,并对其进行了研究。据不完全统计,细菌的假单胞菌属[6]、链霉菌属[7-9]、固氮菌属[10-11]、芽孢杆菌属[12-15]、拟杆菌属[16]、嗜热菌[17]、微杆菌属[18-19]、节杆菌属[20-21],以及真菌的红酵母属[22]皆是左聚糖降解酶的来源,其中对芽孢杆菌属的左聚糖降解酶研究较多。

1.2 性质

3种左聚糖降解酶的主要酶学性质见表1。左聚糖降解酶的最适温度一般为30～50 ℃,在50 ℃以下较稳定。但源于Rhodotorulasp.的左聚糖酶在4 ℃时具有78%的最大活性且相当稳定,而在25 ℃和40 ℃时,残余活性分别只有43%和35%,在70 ℃时完全失活,则该左聚糖酶属于低温酶。大多数左聚糖降解酶的最适pH为酸性,在5.0～6.5之间,仅少数左聚糖降解酶的最适pH为中性。来源于Pseudomonassp. No.43和Streptomycessp. 366L的外切左聚糖酶的最适pH为7.0,来源于Microbacteriumsp. AL-210的左聚糖果糖转移酶的最适pH也为中性,且这3种不同来源的酶均在碱性条件下保持稳定,Microbacteriumsp. AL-210的左聚糖果糖转移酶和Pseudomonassp. No.43的外切左聚糖酶在pH 7.0～8.0范围内保持稳定,Streptomycessp. 366L的外切左聚糖酶在pH 7.0～10.0范围内保持稳定。不同来源或不同类型的左聚糖降解酶,不但能降解左聚糖,而且能降解含有β-2,1-糖苷键的菊粉、蔗糖、棉子糖等。例如:源于Gluconacetobacterdiazotrophicus的外切左聚糖酶不仅水解左聚糖,而且水解蔗糖、菊粉和棉子糖;Thermophilic bacteria的左聚糖酶水解左聚糖、蔗糖和麦芽糖;Rhodotorulasp.的左聚糖酶能水解左聚糖、蔗糖和菊粉;Bacillussp.No.71的内切左聚糖酶水解左聚糖和梯牧草糖;MicrobacteriumlaevaniformansATCC 15953的左聚糖生物水解酶能催化水解左聚糖、菊粉、蔗果三糖和蔗果四糖;StreptomycesexfoliatusF3-2的左聚糖生物水解酶能水解左聚糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖;ArthrobacterureafaciensK2032的左聚糖果糖转移酶能催化左聚糖、蔗果三糖和蔗果四糖。

表1 左聚糖降解酶酶学性质

2 左聚糖降解酶的结构

已报道的左聚糖降解酶(levanase、LF2ase和LFTase)均属于糖苷水解酶32家族。此家族有共同的三维结构特征:由N-端5-折叠β-螺旋浆形成的催化结构域和C-端β-折叠片形成的非催化结构域组成,N-端每个螺旋浆包括4个反向平行的β-折叠片,形成经典的‘W’拓扑结构,辐射状围绕着中心轴,封闭带负电荷的催化活性口袋。每个β-折叠片之间由发卡环连接,每个螺旋浆的β-折叠片1离中心轴最近,并与中心轴平行。整个N-端结构域的形状类似圆柱形,每个螺旋浆β-折叠片4位于圆柱筒的最外面。C-端非催化结构域由2个反向平行的β-折叠片组成,每个β-折叠片包括6股β-折叠线,组装成类似三明治的结构[23],见图1。

图1 左聚糖降解酶的三维结构

3 左聚糖降解酶的应用

3.1 左聚糖果糖转移酶在生产双果糖酐IV中的应用

双果糖酐(DFAs)是一种天然的功能性食品添加剂,由于其甜度远低于蔗糖,并且结构稳定,在高温和极端pH下也能保持稳定,对于糖尿病患者来说,双果糖酐是一种极好的甜味剂[24]。双果糖酐IV是双果糖酐的一种,由左聚糖果糖转移酶催化水解左聚糖生成,双果糖酐IV和双果糖酐Ⅲ具有相同的生理功能,都是不能被肠道消化吸收的寡糖,这些糖被肠道微生物利用,转化为有机酸(乙酸、丁酸和乳酸),从而降低盲肠内的pH值,增强钙的溶解度,达到增强肠道对钙的吸收的目的[25-26]。利用左聚糖果糖转移酶来生产双果糖酐IV是最理想可行的方法。2000年,Song等[21]在土壤中分离到能够产左聚糖果糖转移酶的微生物——ArthrobacterureafaciensK2032,利用酶法生产双果糖酐IV、低聚果糖和果糖,其转化率约为62.5%。Cha等[19]在土壤样品中发现了Microbacteriumsp. AL-210,此细菌可产生左聚糖果糖转移酶,并且双果糖酐IV是该左聚糖果糖转移酶的主要产物,转化率约为44%。Kikuchi等[27]以蔗糖为原料,利用SerratialevanicumNN来生产左聚糖,使ArthrobacternicotinovoransGS-9在大肠杆菌中高度表达,通过ArthrobacternicotinovoransGS-9的左聚糖果糖转移酶将左聚糖一罐转化制备成双果糖酐IV,由于面包酵母不能发酵双果糖酐IV,因此使用酵母发酵来去除双果糖酐IV以外的所有糖,双果糖酐IV的产率高达90.7%,这种不需要分离左聚糖的一罐转化制备方法的优势亦被证实。

3.2 左聚糖酶及左聚糖生物水解酶在低聚果糖生产中的应用

低聚果糖可作为益生元来调节人体肠道微生物菌群的组成,改善肠道环境,从而维持身体健康和治疗疾病,在食品领域具有巨大的市场潜力[28]。由于缺乏可用的植物来源的左聚糖,Porras-Domínguez等[13]首先以蔗糖为原料,利用来源于Bacillussubtilis的左聚糖蔗糖酶生成左聚糖,其次,用Bacilluslicheniformis的内切左聚糖酶水解左聚糖,即可得到左聚糖型低聚果糖,缺点是广泛的水解会使果二糖成为主要产物。为了能够一体化、大量生产左聚糖型低聚果糖,研究者采用一种基于左聚糖蔗糖酶和内切左聚糖酶同时作用的方法高效生产左聚糖型低聚果糖。Höevels等[11]将来源于AzotobacterchroococcumDSM 2286的左聚糖酶基因与GluconobacterjaponicusLMG 1417的左聚糖蔗糖酶基因在大肠杆菌内共表达,大肠杆菌粗提取物利用蔗糖进一步合成左聚糖型低聚果糖。该方法不但成本低,而且效率高,已成功应用于左聚糖型低聚果糖的生产。Rahman等[29]利用一种无载体固定化技术提高了左聚糖酶的稳定性,为左聚糖型低聚果糖的生产奠定了基础。在制备交联左聚糖酶聚集体的过程中加入牛血清白蛋白交联剂比加入戊二醛交联剂得到的固定化酶活力回收率高,从而获得的左聚糖型低聚果糖也较高。因此,所制备的牛血清白蛋白交联左聚糖酶聚合物偶联体可以用于生产低聚果糖,以满足各个领域的市场需求。果二糖也是一种左聚糖型低聚果糖。Saito等[20]发现StreptomycesexfoliatusF3-2可以产生一种外切酶,研究发现该外切酶不仅能水解β-2,6-糖苷键,而且能水解β-2,1-糖苷键,主要水解产物为果二糖。经鉴定,该酶是一种能生产果二糖的左聚糖生物水解酶。Song等[18]将MicrobacteriumlaevaniformansATCC 15953左聚糖生物水解酶基因克隆,并在大肠杆菌内表达,经纯化,该重组酶的主要产物为果二糖。因此,利用水解酶来生产低聚果糖有巨大的发展潜力。

4 展望

左聚糖降解酶的发现在食品领域具有里程碑的意义。近年来,对于左聚糖降解酶的应用研究主要集中在低聚果糖的生产方面,对双果糖酐IV和果二糖的报道较少。左聚糖型低聚果糖的一些生物学功能可以满足工业需求及市场需求,但是实现大规模生产并非易事。不同来源的左聚糖降解酶的活性差异大,且分离纯化困难,大大限制了左聚糖降解酶在工业中的应用,酶分子生物学改造技术能提高酶活力和稳定性,有望解决左聚糖降解酶在工业生产中的问题。因此,对左聚糖降解酶进行深入研究,使其满足工业生产条件,仍是研究的热点。