戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵豆乳特性及风味品质的研究

赵雅冉,李娅馨,赵强,邢少华,孙雪梅,李华敏,2,3*,刘文丽,2,3*

(1.鲁东大学 食品工程学院,山东 烟台 264025;2.鲁东大学 烟台市预制食品纳米科学与技术重点实验室,山东 烟台 264025;3.鲁东大学 食品绿色加工与质量控制烟台市工程研究中心,山东 烟台 264025)

大豆富含蛋白质、酮类及不饱和脂肪酸等营养物质,是肉类和乳制品的主要植物蛋白替代品,且其不含乳糖,可作为包含乳糖不耐受症患者在内的群体获取优质蛋白的来源[1-2]。传统的大豆制品主要以豆腐、豆乳、豆粉和豆豉等为主,大部分豆制品中含有较多的醛类物质,其产生的豆腥味影响了豆制品的感官品质,是制约豆制品产业发展的主要原因。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)因能改善食品的感官品质及丰富食品的营养等被广泛应用于食品发酵[2]。豆乳的营养物质含量丰富,可作为乳酸菌发酵的优良载体[3]。乳酸菌发酵能够有效降低豆腥味,赋予豆乳良好的香气,改善豆乳的感官品质。豆乳发酵过程中产生的苷元、活性酚类物质、维生素和多肽对抑制肿瘤细胞生长、预防肥胖和骨质疏松也有重要作用[4]。此外,乳酸菌能够降解豆乳中的抗营养因子,将大分子化合物分解为可被人体吸收利用的小分子化合物,并产生新的营养物质[5]。利用乳酸菌制备酸豆乳,迎合了当今发酵行业以植物基发酵为创新发展“着力点”的趋势[6]。

菌种是影响发酵食品风味品质的重要因素。Peng等[5]、Zheng等[7]、Wang等[8]分别利用混合乳酸菌、干酪乳杆菌M1以及植物乳杆菌Y16发酵豆乳,发酵后醛类物质减少,醇类、酮类、酸类、酯类等物质增加,有效地改善了豆乳的香气品质,同时营养特性和抗氧化能力显著提高。另有研究表明,利用植物乳杆菌X7021发酵豆乳可以降低豆乳的黏性,同时植物乳杆菌对豆腥味化合物的降解效率大于酸奶发酵剂[3]。戊糖乳植物杆菌是植物基发酵的常用菌种,其发酵性能稳定[9],发酵过程温和[10],植物源材料的利用率高[11],但目前利用戊糖乳植物杆菌发酵豆乳的研究较少。

本文旨在研究戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵豆乳的特性,分析酸豆乳的理化指标与风味物质的组成,解析酸豆乳的关键风味物质。采用多种差异物质分析方法,确定酸豆乳区别于豆乳的关键差异风味物质,为酸豆乳风味的生成和调控提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆、绵白糖:均购于烟台当地超市;戊糖乳植物杆菌(Lactiplantibacilluspentosus)PY1-6(分离于泡菜):本实验室保藏;蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏和琼脂(均为生物试剂):北京奥博星生物技术有限公司;柠檬酸氢二铵、硫酸镁、硫酸锰、磷酸氢二钾、碳酸钙、乙酸钠、碳酸钠、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠和氯化钠(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司;牛血清白蛋白:上海洛神生物技术有限公司;正构烷烃(C7～C30)、2-甲基-3-庚酮(色谱纯):美国Sigma公司;乙腈(色谱纯):德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

立式高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;AB33PH-F pH计 奥豪斯仪器(上海)有限公司;恒温培养振荡器 天津欧诺仪器股份有限公司;721G可见分光光度计 上海精科实业有限公司;A-45-24-11九阳破壁机 九阳股份有限公司;H1650-W离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;CT-3 质构仪 美国Brookfield公司;57330-U型固相微萃取手柄、57328-U型固相微萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS,StableFlex) 美国Supelco公司;DB-WAX型熔融石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 安捷伦科技(中国)有限公司;GC/MS-QP2020NX单四极杆型气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 酸豆乳制备

参照Zheng等[7]制备酸豆乳的方法并稍作修改。选用颗粒饱满的干黄豆,清洗干净,加入9倍干黄豆重量的水,25 ℃恒温浸泡12 h,浸泡后的黄豆与水一起加入破壁机中打浆45 min,制备的豆浆在121 ℃灭菌15 min,冷却至室温后的豆浆加入6%的绵白糖搅拌均匀。

1.3.2 酸豆乳发酵

将戊糖乳植物杆菌PY1-6接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h,4 ℃、4 000 r/min离心5 min,收集菌体,用生理盐水洗涤菌体2次,离心去除上清液,加入无菌水补充至原体积。按6%接种至豆浆中,37 ℃静置发酵6 h获得酸豆乳。

1.3.3 乳酸菌总数测定

每间隔1 h取样,梯度稀释,涂布于MRS平板,37 ℃培养48 h,结果以lg CFU/g表示。

1.3.4 pH值测定

取10 mL酸豆乳搅拌均匀,使用pH计测定样品的pH值。

1.3.5 总酸测定

参照Zhang等[12]的方法,取20 g酸豆乳样品,用0.1 mol/L的NaOH滴定样品至pH为8.2±0.2,记录NaOH用量,测定数值以g/kg表示。

1.3.6 蛋白质浓度测定

取1 g酸豆乳,梯度稀释。采用福林酚试剂法,以250 μg/mL的牛血清白蛋白绘制标准曲线,测定酸豆乳样品在660 nm处的吸光度,计算酸豆乳中的蛋白质含量。

1.3.7 质构测定

质构参数测定:TA-4圆柱形探头直径为50 mm,测试速度为1.0 mm/s,穿透距离为15 mm,表面触发力为5 g[13]。利用Exponent软件计算硬度(N)和黏附力(N)。

1.3.8 持水率测定

参照Bian等[14]的方法并稍作修改,取5 g样品,4 ℃、8 500 r/min离心20 min,去除上清液,计算酸豆乳的持水率。持水率计算公式如下:

式中:WHC(water holding capacity)为持水率;W0为空离心管的重量(g);W1为样品与离心管离心前的重量(g);W2为样品与离心管离心后的重量(g)。

1.3.9 挥发性风味物质检测

对戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵后的酸豆乳(PY1-6组)和未发酵的豆乳(CK组)进行挥发性风味物质分析,参照Peng等[5]的方法并稍加修改。

萃取条件:将5 g样品和3 μL 2-甲基-3-庚酮(0.01 mg/mL)内标溶液加入到15 mL顶空瓶中。45 ℃、300 r/min搅拌孵育25 min,插入萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)萃取40 min。

GC条件:配置有DB-WAX熔融石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)的GC-MS系统;以高纯度氦气(1.0 mL/min)为载气。40 ℃保持3 min,然后以5 ℃/min升至200 ℃,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持10 min,进样口温度250 ℃,不分流进样。

MS条件:全扫描范围内的电子碰撞电离能为70 eV,离子源温度为200 ℃,发射电流为200 μA,检测电压为350 kV,质谱扫描范围为55～550 u。

GC-MS检测结果通过标准物质质谱数据库(NIST 17)检索处理,统计匹配度大于80%的挥发性成分,同时根据相同色谱条件下C7～C30正构烷烃的保留时间计算检测物质的保留指数(retention index, RI),并与质谱库以及文献资料中的RI值进行比对,对挥发性化合物进行定性。挥发性化合物含量采用内标半定量法,根据化合物与内标物峰面积的比值进行计算[12],定量公式如下:

式中:Ci为样品中待测物质的质量浓度(μg/kg);Cs为2-甲基-3-庚酮浓度(μg/kg);Ai为样品中待测物质对应的色谱峰面积;As为内标物色谱峰面积。

香气活性值(OAV)是挥发性化合物的浓度与其气味阈值(odor threshold, OT)的比率[15],挥发性化合物的OAV>1被认为是主要香气化合物,其OAV越大,对香气的贡献越大。

式中:Ci为待测样品中挥发性化合物浓度(μg/kg);OTi是该物质在水中的风味阈值(μg/kg)。

1.3.10 感官评定

PY1-6发酵前后的豆乳根据定量描述性分析(quantitative descriptive analysis,QDA)要求进行感官评定,感官评定小组由7名女性和6名男性组成,从色泽、豆腥味、酸味、香味、黏稠度5个方面按照1～9由弱到强对发酵豆乳进行评分。

1.3.11 数据处理

2 结果与分析

2.1 发酵特性及理化指标

由图1可知,发酵6 h后,酸豆乳的乳酸菌菌数和总酸分别上升至(9.11±0.02) log CFU/g和(7.53±0.02) g/kg,pH下降至5.12±0.01,蛋白质含量下降至0.608 mg/g,表明戊糖乳植物杆菌PY1-6在酸豆乳中表现出良好的发酵性能;酸豆乳的总酸与pH的变化主要是由发酵产生的乳酸等有机酸导致的,提高总酸的同时能丰富酸豆乳的风味[5]。总酸与活菌数在发酵4 h后趋于稳定,结合pH、总酸以及活菌数的变化进行分析,可能是总酸的升高对戊糖乳植物杆菌的生长起到了抑制作用[16]。

图1 酸豆乳发酵过程中乳酸菌菌数及理化指标变化

2.2 质构与持水率

硬度、黏附力和持水率是影响酸豆乳理化性质和品质的重要因素。戊糖乳植物杆菌PY1-6对酸豆乳质构特性和持水率的影响见图2。

图2 酸豆乳的持水率和质构变化

由图2可知,发酵前期,酸豆乳的硬度、黏附力、持水率都呈现上升趋势。酸豆乳的硬度和黏附力主要取决于酸豆乳的pH,pH在4.5～5.5之间会引起大豆蛋白变性,导致酸豆乳的硬度和黏附力上升。持水率主要反映了酸豆乳对水的结合能力,发酵后期,酸豆乳的持水率呈现先下降后上升的趋势, 硬度呈现下降的趋势,与孟岳成等[17]的实验结果相似。酸豆乳开始出现乳清析出,推测酸豆乳中的乳清析出是导致其质构下降的原因。戊糖乳植物杆菌PY1-6在发酵时产生的胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)能够有效提高酸豆乳的质构和持水率[18]。因此,后期可以通过优化酸豆乳中糖的含量,提高胞外多糖的产量以提高酸豆乳的品质[19]。

2.3 挥发性风味物质分析

由表1可知,未发酵豆乳(CK组)和戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵的酸豆乳(PY1-6组)中共鉴定出24种挥发性风味化合物,包括10种醇类、8种醛类、3种酮类、2种酸类以及1种呋喃类。由图3中A可知,CK组与PY1-6组共有13种相同的挥发性风味物质,醇类和醛类物质是主要的差异物质。发酵后的酸豆乳中醇类物质占比从47.88%上升至71.76%,醛类物质占比从38.60%降低至20.55%,酸类物质占比上升至6.42%,酮类物质发酵前后占比变化较小,醇类与醛类物质的显著变化是影响酸豆乳风味的主要原因。醇类和酸类物质在发酵后明显增多,醛类和呋喃类物质被降解,含量明显降低,另外,酯类和酮类物质显著增加,发酵前后风味物质的变化表明戊糖乳植物杆菌PY1-6可以有效提高酸豆乳的香气质量。

A

为了更好地分析戊糖乳植物杆菌PY1-6对酸豆乳风味的影响,采用热图对风味物质的组成进行聚类比较。由图4可知,CK组与PY1-6组醛类与醇类物质差异显著,豆乳在发酵前,腥味物质如壬醛、正戊基呋喃和2-乙基己醇含量较高,这些腥味物质主要是大豆在被破坏后,其中的亚麻酸、亚油酸在脂氧合酶以及氧气的作用下催化生成,它们一般为6～9个碳原子的醛类或醇类物质[27-28],特别是壬醛,具有较重的青草味和柑橘皮味,是豆乳的主要腥味物质[29]。发酵后的酸豆乳中未检测到壬醛、正戊基呋喃和2-乙基己醇,说明戊糖乳植物杆菌发酵可以有效降低豆乳的腥味,提高其风味品质[30]。

图4 酸豆乳风味物质热图

2.3.1 醇类物质

在CK组与PY1-6组中分别检测出8种和9种醇类物质(见表1)。醇类物质不仅可以由葡萄糖或氨基酸分解代谢生成,而且可以通过脱氢酶还原醛或其他物质得到,PY1-6组苯甲醇(OAV=1 471.41)、正庚醇(OAV=591.57)、正己醇(OAV=33.37)、辛醇(OAV=23.74)和苯乙醇(OAV=2.46)的OAV都大于1,对酸豆乳的香气有较大影响,是酸豆乳的关键风味物质[31-32],主要呈现果香和坚果香。其中,具有柑橘香和果香的辛醇主要由辛醛和壬醛在脱氢酶的作用下还原得到,发酵后含量显著增加,减少了壬醛的青草味,有效降低了酸豆乳的豆腥味,增加了柑橘香以及果香味[32-33]。

2.3.2 醛类物质

大多数醛类是氨基酸分解代谢、酮酸脱羧或不饱和脂肪酸分解的初级产物[20]。醛类物质是发酵中代谢较快的物质,它们会迅速还原成醇类物质或者氧化为酸类物质,经发酵后醛类物质的改变可以显著改善酸豆乳的风味[16]。醛类物质的阈值较低,对风味的贡献较大,CK组与PY1-6组中分别检测出5种和7种醛类物质(见表1),CK组中对风味影响较大的是癸醛(OAV=10 211.08)、反式-2,4-癸二烯醛(OAV=2 762.01)和壬醛(OAV=1 254.33);PY1-6组对风味影响较大的是反式-2,4-癸二烯醛(OAV=14 754.62)、癸醛(OAV=13 896.97)、反式-2-壬烯醛(OAV=4 734.86)、反式-2,4-庚二烯醛(OAV=1 714.37)和反式-2-辛烯醛(OAV=446.74)。经戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵后反式-2-壬烯醛(黄瓜味)、反式-2,4-庚二烯醛(坚果香)和反式-2-辛烯醛(果香、香甜味)显著上升,这3种醛类物质是酸豆乳中果香味的主要风味物质,能够赋予酸豆乳更丰富的香味;反式-2,4-癸二烯醛(油脂味)经发酵后显著增加,使得豆乳呈现淡淡的油脂香味。豆腥味是影响豆乳类产品接受度的主要因素之一,壬醛、2-正戊基呋喃和顺式-2-辛烯-1-醇都具有“青草味”,也称为“草味”和“氧化油味”,是豆腥味的来源[34]。壬醛的青草味是CK组中腥味的主要来源,主要由油酸氧化而来[22]。壬醛在脱氢酶的作用下还原成辛醇,是酸豆乳豆腥味降低的关键因素[29]。癸醛(肥皂味、油脂味)的存在增加了酸豆乳中的脂肪和肥皂气味,癸醛可能是由氨基酸的降解反应、脂质的氧化和降解产生的[35]。

2.3.3 酮类物质

由表1可知,CK组与PY1-6组分别检测出2种和3种酮类物质,酮类物质多数是由游离脂肪酸氧化和氨基酸降解产生的[16],大多具有怡人的香气[22]。具有甜味的2-庚酮是酸豆乳中的典型香气化合物,主要来源于亚油酸的生物转化[7,36],经过戊糖乳植物杆菌PY1-6的发酵后含量上升;通过发酵产生带有香味与蘑菇味的3-辛酮,虽然OAV<1,但它对掩盖醛类物质的豆腥味也具有一定的作用;具有蘑菇味的6-甲基-5-庚烯-2-酮发酵前后变化不显著。

2.3.4 酸类物质

有机酸的生成对豆乳的发酵有着重要影响,不仅可以酸化大豆蛋白提高酸豆乳的黏度,而且可以提供独特的香气。酸类物质主要来源于脂肪的分解[37],经戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵后的酸豆乳中检测出己酸和辛酸两种酸类物质,己酸本身具有干酪香味和酸味,可为酸豆乳提供特殊的奶酪味。两种酸类物质在发酵后显著增加,但是由于阈值较高,不能为酸豆乳的风味作出较大贡献。

2.3.5 呋喃类物质

呋喃类化合物通常由焦糖化反应和碳水化合物降解产生。CK组2-正戊基呋喃(OAV=179.83)是一种由大豆亚油酸产生的芳香化合物[3],具有明显的青草味和豆腥味,是豆乳中主要的腥味物质。研究发现,乳酸菌发酵会导致2-正戊基呋喃含量下降,减少了酸豆乳中的豆腥味,对改善豆乳的风味具有极为重要的作用[38]。前期研究表明,豆乳经过植物乳杆菌X7021发酵后,2-正戊基呋喃含量由40.2%下降至13.5%,证明植物乳杆菌能够显著降低酸豆乳中的2-正戊基呋喃含量[3]。本研究中的戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵豆乳后未检测出2-正戊基呋喃,表明戊糖乳植物杆菌对2-正戊基呋喃有着更强的降解作用,能够更好地改善酸豆乳的豆腥味。

2.4 关键差异风味物质分析

对CK组与PY1-6组进行PLS-DA分析,结果见图5。

图5 偏最小二乘法判别分析评分图

两组的挥发性风味化合物各自呈良好的聚类,有较好的重复性和数据可靠性。两组样品中挥发性风味化合物沿PC1(76.1%)和PC2(7.52%)严格区分,累计方差贡献率高达83.62%。

为进一步分析CK组与PY1-6组风味物质的差异,使用偏最小二乘回归分析(PLS-DA)对CK组与PY1-6组的关键风味物质进行分析,筛选可变影响投影(variable influence projection,VIP)大于1的物质作为差异风味物质。由图6可知,有15种VIP值大于1的物质被筛选为豆乳与酸豆乳中的差异物质。差异风味物质中的2-庚酮(甜味)、正庚醇(坚果香)、苯乙醇(花香)、正己醇(果香、红酒香)、辛醇(柑橘香、果香)、反式-2-辛烯醛(果香、香甜味)、苯甲醇(花香、果香)和反式-2,4-庚二烯醛(坚果香)8种物质的OAV均大于1,是酸豆乳区别于豆乳的关键差异风味物质。

图6 挥发性风味化合物可变影响投影(VIP)得分图

图7直观地表示了风味物质浓度的变化,虚线上方为戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵后新生成或消失的物质,虚线下方为浓度变化超过2倍的风味物质。豆乳经发酵后新生成了3-辛酮、反式-2,4-庚二烯醛、反式-2-壬烯醛等8种风味物质,赋予酸豆乳芳香、黄瓜味、果香、坚果香等风味。带有豆腥味的2-正戊基呋喃、2-乙基己醇、壬醛3种物质在发酵后消失,减轻了酸豆乳的豆腥味。戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵后有9种物质含量上升,4种物质含量下降,其中苯甲醇、辛醇、苯乙醇、正己醇、反式-2,4-癸二烯醛和1-戊醇6种物质发酵后含量增加超过2倍,赋予酸豆乳甜香、花香、柑橘香、果香、油脂香等风味。

图7 挥发性风味物质变化差异图

为了更好地确定酸豆乳区别于豆乳的关键差异标记物,对OAV>1、可变影响投影(VIP)>1和浓度差异大于2倍的物质(FC>2,或FC<0.5,或新生成,或消失)进行综合分析比较,筛选CK组与PY1-6组中的关键差异标记物。由图8可知,有7种挥发性风味化合物是戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵后酸豆乳区别于豆乳的主要差异香气化合物,分别是反式-2,4-庚二烯醛(油脂味、坚果香)、反式-2-辛烯醛(果香、香甜味)、苯甲醇(甜香、花香、果香)、正庚醇(坚果香)、正己醇(果香)、辛醇(柑橘香)和苯乙醇(花香)。另外,在酸豆乳中新生成的反式-2-壬烯醛的VIP=0.99,虽然VIP值小于1,但是发酵后该物质的OAV=4 734.86,推测反式-2-壬烯醛也是酸豆乳区别于豆乳的关键差异风味物质。8种挥发性风味化合物共同的特点是以果香为主要香气,赋予了酸豆乳较浓厚的香甜气味。

2.5 感官评定

由图9可知,豆乳经戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵后色泽变化较小,均呈现乳白色;发酵后的酸豆乳豆腥味显著改善,主要与具有青草味的壬醛和2-正戊基呋喃含量降低有关;香味的改善主要与反式-2-壬烯醛、反式-2,4-庚二烯醛、反式-2-辛烯醛、苯甲醇、正庚醇等具有果香味的风味化合物有关;酸豆乳的黏稠度可能与戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵生成的胞外多糖有关。酸豆乳感官整体优于未发酵的豆乳,表明戊糖乳植物杆菌PY1-6可用于豆乳发酵。

图9 QDA法分析酸豆乳的感官特性

3 结论

本文利用从泡菜中分离的戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵豆乳,对酸豆乳进行发酵特性、理化指标及风味物质分析。经戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵后的豆乳pH降至5.12,同时表现出较好的硬度与黏度。通过风味物质分析可知,反式-2,4-癸二烯醛(OAV=14 754.62)、癸醛(OAV=13 896.97)、反式-2-壬烯醛(OAV=4 734.86)、反式-2,4-庚二烯醛(OAV=1 714.37)、反式-2-辛烯醛(OAV=446.74)等对酸豆乳的风味贡献较大,是酸豆乳中的关键风味物质,主要赋予酸豆乳油脂香、黄瓜味、坚果香、果香和香甜味等风味。综合分析OAV、VIP以及风味物质浓度变化等,推测反式-2-壬烯醛、反式-2,4-庚二烯醛、反式-2-辛烯醛、苯甲醇、正庚醇、正己醇、辛醇和苯乙醇8种物质是酸豆乳区别于豆乳的关键差异风味标记物。壬醛(豆腥味、青草味、柑橘味)和2-正戊基呋喃(豆腥味、青草味)的香气活性值较大,是豆乳中豆腥味的主要来源,经戊糖乳植物杆菌PY1-6发酵后消失,明显改善酸豆乳的豆腥味。综上来看,戊糖乳植物杆菌PY1-6可以改善酸豆乳的风味,可作为豆乳发酵的优良菌株。