血清CXCL9和IL-34水平检测对多发性骨髓瘤患者的疗效监测及其预后价值

任 梅，石培民，谢 静，季 国，李 娟，叶春美，许 荟(泰兴市人民医院血液内科，安徽阜阳 236000)

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种以骨髓微环境中浆细胞克隆增殖为特征的血液恶性肿瘤[1]，占所有恶性肿瘤的1.3%和血液系统肿瘤的15%[2-3]。MM的早期临床表现无特异性，随着病情发展，可出现骨痛、病理性骨折、肝、脾、肾病变等症状，容易因误诊而延误治疗，造成MM患者五年生存率仍然较低[4-5]。因此，寻找能够准确诊断MM，评估疾病进展和确定患者预后的有效生物标志物尤为重要。C-X-C基序趋化因子配体9（C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9）是CXC趋化因子亚家族成员之一，在炎症条件下可由肿瘤微环境中的髓细胞产生，对T淋巴细胞具有趋化作用，并在肿瘤进展中发挥促癌作用[6-8]。白细胞介素-34（interleukin-34，IL-34）具有促进巨噬细胞增殖、分化及多种炎症因子分泌的作用[9]。而炎症反应是影响肿瘤微环境的重要部分，研究报道炎症因子可间接反映骨髓微环境情况[10]，推测CXCL9和IL-34在MM中可能发挥重要作用。本研究旨在通过检测MM患者血清中CXCL9和IL-34的表达情况，探讨其对MM疾病的诊断、疗效监测以及预后评估价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年6月～2019年1月在泰兴市人民医院进行治疗的MM患者为研究组，男性54例，女性47例，年龄51～78（60.80±5.40）岁。另外选取与患者性别和年龄匹配的健康体检志愿者95例为对照组，男性48例，女性47例，年龄52～80（60.18±6.80）岁。纳入标准：①研究组所有患者均符合《中国多发性骨髓瘤诊断与治疗指南(2017年修订版)》中规定的相关诊断标准[11]；②MM患者均经活检证实；③所有患者均接受硼替佐米基础化疗（3次以上）。排除标准：①并发其他恶性肿瘤；②并发其他血液系统疾病的患者；③严重的心、肝、肾等脏器疾病；④妊娠期MM患者；⑤临床资料不完整者。研究经我院道德伦理委员会批准通过，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 仪器与试剂 CXCL9 ELISA试剂盒（E-ELH6062，Elabscience）；IL-34 ELISA试剂盒（EH2043，FineTest）；全自动生化分析仪（型号Cobasc 701，罗氏）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：收集MM患者化疗前及化疗结束2周后的静脉血样本4～5 ml，健康体检者于体检当日清晨采集空腹静脉血4～5 ml，采集后2 h内处理，2 400 r/min离心10 min。血清样本保存在-80℃,供进一步使用。整理入组患者临床资料包括：年龄、性别、D-S分期、ISS及R-ISS分期、乳酸脱氢酶（LDH）、血红蛋白、血钙、清蛋白、肌酐、血清β2-微球蛋白、轻链类型、免疫分型等。

1.3.2 血清中CXCL9，IL-34水平检测：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中CXCL9，IL-34水平。检测步骤按照试剂盒说明书严格进行。

1.3.3 随访及疗效评估：随访开始时间从诊断日计算，采用门诊或电话的方式每3个月随访一次，截止时间为2022年1月，终点事件定义为患者死亡。

疗效评估：患者接受化疗后出现病情进展（progressive disease，PD）或未得到有效控制归入治疗未获益组；患者接受化疗后出现完全缓解（complete response，CR）、部分缓解（partial response，PR）或疗效稳定（stable disease，SD）归入治疗获益组。

1.4 统计学分析 本研究采用SPSS 20.0统计软件对所得数据进行处理。两组独立资料、正态方差齐计量资料均以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，多组数据比较利用单因素方差分析；化疗前后患者血清CXCL9和IL-34水平比较，采用配对t检验；采用ROC曲线分析血清CXCL9和IL-34对MM的诊断效果。Kaplan-Meier法分析MM患者血清中不同CXCL9和IL-34表达水平与患者生存时间的关系，并绘制生存曲线；多因素COX回归风险模型分析MM患者的预后影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MM患者化疗前血清中CXCL9和IL-34的表达及对MM的诊断价值分析 MM患者血清CXCL9（950.56±180.11 pg/ml），IL-34表达水平（15.53±4.26pg/ml）较对照组明显升高（273.03±50.19 pg/ml，3.05±0.81 pg/ml），差异具有统计学意义（t=35.391，28.077；P=0.000，0.019）。见图1。ROC结果显示，CXCL9和IL-34诊断MM的AUC分别为0.841（95%CI：0.782～0.889），0.869（95%CI：0.814～0.913），截断值分别为386.89 pg/ml，4.75 pg/ml。对应的敏感度分别为92.08%，84.16%，特异度分别为83.16%，91.58%。二者联合诊断MM的AUC为0.915（95%CI：0.866～0.950），对应的敏感度和特异度分别为94.06%和74.74%。高于CXCL9（z=42.168，P=0.030）和IL-34（z=1.569，P=0.117）任一单项指标。

图1 化疗前血清中CXCL9，IL-34水平诊断MM的ROC曲线

2.2 化疗前血清中CXCL9和IL-34表达与MM患者临床病理参数的关系 见表1。CXCL9和IL-34在MM患者血清中的表达与患者D-S分期、ISS，R-ISS，LDH，清蛋白、血钙有关（均P<0.05）。

表1 MM患者化疗前血清中CXCL9，IL-34表达与临床病理参数的关系（±s，pg/ml）

表1 MM患者化疗前血清中CXCL9，IL-34表达与临床病理参数的关系（±s，pg/ml）

类 别nIL-34F/tPCXCL9F/tP性别男54957.69±184.420.4260.67116.04±4.351.2940.199女47942.37±175.1514.94±4.16年龄（岁）>6046955.83±186.100.2690.78916.18±4.361.3970.165≤6055946.16±175.1114.99±4.18 D-S分期 Ⅰ+Ⅱ18726.16±135.255.7820.00010.27±4.025.7760.000Ⅲ83999.23±189.8416.67±4.31 ISS Ⅰ+Ⅱ32870.83±188.453.0290.00311.03±4.067.2190.000Ⅲ69987.54±176.2417.62±4.36 R-ISS Ⅰ+Ⅱ79917.87±182.883.4540.00114.41±3.924.9600.000Ⅲ221 067.95±170.1819.55±5.48免疫球蛋白分型IgG43919.65±160.92 1.1840.319 14.56±3.87 IgA28945.63±174.8615.48±4.32 IgD4972.87±188.8916.26±4.41轻链型261 003.56±216.1517.09±4.82 β2-微球蛋白（mg/L）>3.5 66953.74±184.320.2430.80815.83±3.920.9610.339≤3.535944.57±172.1814.97±4.90轻链类型κ57941.29±185.110.5880.55816.23±4.411.8690.065 λ 1.9330.129 44962.57±173.6414.63±4.07血红蛋白（g/L）< 85 37972.48±186.430.9300.35516.31±4.421.3970.165≥ 8564937.89±176.4615.08±4.17血肌酐（μmol/L）< 176 80933.01±182.731.9100.05915.14±4.231.7890.077≥ 176 211 017.42±170.1517.01±4.39 LDH（ U/L）< 23067901.07±189.033.8650.00014.54±4.223.2860.001≥ 230341 048.08±162.5417.49±4.35清蛋白（g/L）≥ 3546871.15±192.344.0450.00012.25±3.777.0440.000< 35551 016.98±169.8918.28±4.67血钙（ mmol/L）≥ 2.6577986.75±188.483.6010.00016.86±4.345.6160.000< 2.65 24834.45±153.2611.26±4.01

2.3 患者血清CXCL9，IL-34水平与化疗疗效的关系 见表2。与化疗前相比，治疗获益组和治疗未获益组化疗后患者血清CXCL9和IL-34表达水平显著下降，差异具有统计学意义（t=44.746，32.924，13.692，11.365，均P=0.000）。与治疗未获益组相比，治疗获益组患者化疗后血清中CXCL9和IL-34表达水平均较低，差异具有统计学意义（t=19.508，17.247，均P=0.000）。

表2 患者血清CXCL9，IL-34水平与化疗疗效的关系（±s，ng/ml）

表2 患者血清CXCL9，IL-34水平与化疗疗效的关系（±s，ng/ml）

组 别nCXCL9IL-34治疗获益组化疗前65923.21±175.7814.96±4.10化疗后65341.21±44.764.21±0.59治疗未获益组化疗前36999.95±187.9316.57±4.55化疗后36774.83±169.4512.17±3.65

2.4 MM患者化疗前血清CXCL9和IL-34水平与预后的关系 101例MM患者共随访36个月，随访期间无失访病例，统计共生存69例，死亡32例，生存率为68.32%。CXCL9，IL-34均以在MM患者血清中表达均值为分组标准，超出该范围判定为高表达组，低于该范围为低表达组。其中CXCL9低表达组43例，高表达组58例；IL-34低表达组48例，高表达组53例。见图2。绘制三年生存曲线，Kaplan-Meier分析结果显示，CXCL9低表达组患者三年累积生存率81.40%（35/43），显著高于高表达组的58.62%（34/58），差异有统计学意义（Log rankχ2=6.580，P=0.010）。IL-34低表达组患者三年累积生存率79.17%（38/48），显著高于高表达组的58.49%（31/53），差异有统计学意义（Log rankχ2=5.658，P=0.017）。

图2 化疗前血清CXCL9，IL-34水平与预后的关系

2.5 MM患者生存状况的COX回归分析 见表3。单因素COX风险回归模型分析结果显示，患者CXCL9，IL-34，β2-微球蛋白、血钙、血肌酐和LDH与MM患者预后相关（均P<0.05）。多因素COX风险回归模型分析结果显示，CXCL9，IL-34，β2-微球蛋白、血钙、血肌酐和LDH均为影响MM患者预后的独立危险因素（均P<0.05）。

表3 MM患者生存状况的COX回归分析

3 讨论

MM发病率在世界范围内不断增加[12-13]，尽管蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物和单克隆抗体等对MM的治疗取得了显著进展，但由于大多数患者反复复发，MM仍然无法治愈[14-15]。此外，由于该病的异质性，导致患者预后不同[16]。因此，研究新的生物标志物来诊断MM的预后，以帮助改善MM的预后和治疗。

IL-34是白细胞介素家族的一员，由多种细胞产生，包括巨噬细胞、成纤维细胞和肝细胞[17]。IL-34的失调与多种疾病有关，包括炎性肠病、类风湿关节炎、慢性心力衰竭和缺血/再灌注损伤引起的急性肾损伤等[18-19]。本研究结果显示MM患者血清中IL-34表达水平高于健康人群，在进行治疗后，治疗获益组MM患者血清中IL-34表达水平明显降低，表明患者在进行治疗后肿瘤生长得到有效控制，因此IL-34表达水平降低，提示IL-34可能作为判断MM患者化疗疗效的独立生物标志物。通过与MM患者临床病理特征相关性分析可知，IL-34表达与D-S分期、ISS，R-ISS，LDH，清蛋白和血钙有关，提示IL-34反映了疾病的活动性，其表达异常与肿瘤转移、增殖等过程有关，其作用机制可能是炎症细胞因子分泌过量对细胞DNA造成一定程度损伤，导致肿瘤细胞的免疫逃逸及快速增殖，进而参与肿瘤进展；ROC结果发现IL-34对诊断MM疾病有良好的敏感度和特异度，可能作为诊断疾病的潜在标志物。绘制生存曲线，分析结果显示IL-34低表达患者三年累积生存率显著高于高表达患者，提示IL-34是MM预后的重要指标，其表达升高不利于患者生存预后，临床可通过降低IL-34表达水平，降低MM患者不良预后发生率，提高生存率。

CXCL9是一种被IFN-γ诱导产生的单核因子，作用是诱导趋化，促进白细胞增殖和分化，引起组织外渗。近年来研究发现CXCL9在多种癌症类型中存在异常表达，且与多种癌症疾病的临床病理特征相关[20-21]。因此，CXCL9可能在肿瘤的发生、生长和转移过程中起作用，并可能作为肿瘤的基本预后因素。然而，CXCL9在MM中的作用及其可能的分子机制尚未得到解释，因此有必要进一步探索。在本研究中CXCL9表达水平相较于健康人群升高，在治疗获益组MM患者血清中表达显著降低，提示CXCL9参与MM疾病发生，通过检测化疗前后CXCL9的水平可以反映患者化疗疗效，可能作为判断MM患者疗效监测的辅助指标。CXCL9表达与D-S分期、ISS，R-ISS，LDH，清蛋白和血钙有关，表明临床可通过检测CXCL9的表达水平反映疾病进展，其作用机制可能是CXCL9表达升高后刺激肿瘤细胞增殖，此外可能通过降解细胞外基质等诱导肿瘤细胞的侵袭和迁移[22]，具体机制需要进一步研究。基于本研究结果，我们有理由认为，若MM患者血清CXCL9和IL-34水平均持续升高，应警惕骨髓内浆细胞恶性增生能力不断增强，病情处于进展中。预测效能分析显示CXCL9与IL-34联合诊断MM患者的AUC高于二者单独指标检测诊断效能，表明二者联合检测可提高疾病诊断的敏感度及特异度，对MM的早期诊断具有重要参考价值。此外，CXCL9高表达患者三年累积生存率显著低于低表达患者，提示CXCL9高表达不利于患者预后，有可能作为预测患者预后不良的潜在生物指标，临床医师可通过调控CXCL9的表达，改善患者的预后；研究发现CXCL9，IL-34，β2-微球蛋白、血钙、血肌酐和LDH均是影响MM患者预后的独立危险因素，进一步表明CXCL9和IL-34表达异常与MM疾病发生发展及预后密切相关。临床可根据以上危险因素制定适合患者的有效治疗方案，以期改善患者的预后。

综上所述，MM患者血清中CXCL9和IL-34均呈高表达，二者与MM患者临床特征及预后密切相关，联合检测二者表达对MM早期诊断、疗效监测及生存预后具有重要意义，并可为MM致病机制的深入研究提供新思路。但本研究纳入的MM病例数量少、随访时间不够长，需要更长时间的随访和更大的样本量来进一步验证研究结果。